ICS 67.120.10 X 10 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3607—2020 农产品中生氰糖苷的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of cyanogenic glycosides in agricultural products- Liquid chromatography with tandem-mass spectrometry method 2020-03-20发布 2020-07-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3607—2020 前 本标准由农业农村部乡村产业发展司提出。 本标准由农业农村部农产品加工标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：浙江大学、农业农村部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（杭州）、中国热带 农业科学院热带作物品种资源研究所。 本标准主要起草人：陆柏益、钟永恒、吴筱丹、黄伟素、李士敏、李开绵、张振文、徐涛、王蒙蒙。 I NY/T3607—2020 农产品中生氰糖苷的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了农产品中生氰糖苷的测定方法的原理、试剂和材料、仪器和设备、试样制备、分析步骤、 结果计算、精密度等。 本标准适用于木薯、亚麻籽、苦杏仁、竹笋、高粱等含氰化物农产品中8种生氰糖苷类化合物含量的 测定。 2规范性引用文件 PUBLI 下列文件对于本文 ，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（包括所有的 修改单适 GB/T6682 子析实验室用水 规格 A RE 3 原理 经8 甲醇水溶液提取固相萃取柱净化液相色谱 联质谱测定，外标法定量。 试样中生氰糖苗 EAI AL 4 试剂和材料 以下所用的试 剂除果 有说明外均为分析纯试剂，无 水为符合GB 6682 的口级 水 H.CAS CH 甲醇CH,C ：67-56-1)：色谱纯。 4. 2 乙腈（CH3C NICAS 4. 3 甲酸（HO H,CAs 4. 4 甲酸水溶液 准确吸取工00mL甲酸（4 4. 5 甲醇水溶浴 mL甲醇（4.1) mL水 4. 6 甲醇水溶液 4.7 甲醇乙腈溶液 ml 醇 加70mL乙睛， 4.88种生氰糖苷标准品 纯度 见附 永 4.9E 固相萃取柱：N-乙烯吡咯烷酮和 飞烯 或其他等效柱。使用前 用2mL甲醇和2mL水活 4.10 微孔滤膜：13mm×0.22 4.11生氰糖苷标准溶液配制 4.11.1标准储备溶液（100mg/L)：准确称取生氰糖甘标准品1mg（精确至0.01mg），用甲醇（4.1)溶 解，转移至10mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.1)定容，配成浓度为100mg/L标准储备溶液，于一18℃保存， 保存期2个月。 4.11.2标准中间工作溶液（1mg/L)：分别移取100μuL的8种生氰糖苷标准储备溶液（4.11.1)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.1)定容，得1mg/L标准中间工作溶液，现用现配。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg。 5.3分析研磨机。 NY/T3607—2020 5.4涡旋振荡器。 5.5离心机：带有15mL转子,转速≥5000r/min。 5.6真空过柱装置。 5.7走 超声波清洗器：功率≥500W。 5.8氮吹仪。 6试样制备 新鲜样品用水洗净表面附着的杂物，用吸水纸水分擦干，取可食部，切碎，放人研磨杯中，加人液氮冷 冻后用研磨机粉碎至颗粒均匀；固体干样品取可食部，粉碎后过0.20mm筛。样品制备后连续完成7.1~ 7.2的全部过程。 7分析步骤 7.1提取 称取1g试样（精确到0.1mg）于15mL离心管中，加人3mL甲醇水溶液（4.5），涡旋振荡15s，超声 提取15min（500W），立即于4200r/min离心10min，取全部上清液；往残渣中再次加人3mL甲醇水溶 液，按上述条件提取、离心，合并2次提取液于10mL容量瓶中，加水至刻度线，混匀，待净化。 7.2净化 将活化好的固相萃取柱（4.9)连接到真空过柱装置（5.6)，将7.1中制备的粗提液转移至萃取柱中，待 样液全部流过柱子后，弃去流出液。用2mL水淋洗柱子并彻底抽干，弃去淋洗液。用3mL甲醇乙腈溶 液（4.7)洗脱柱子，分次洗脱，每次1mL，流速1mL/min，收集全部洗脱液。洗脱液氮气吹干（40℃)后， 用1mL甲醇水溶液（4.6)复溶。过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。 7.3测定 7.3.1色谱参考条件 色谱柱：UPLCCs（50mmX2.1mm，1.8μm）色谱柱，或同等性能的色谱柱； 流动相及洗脱条件见表1； 表1流动相及梯度洗脱参考条件 时间 流动相A(0.1%甲酸水溶液) 流动相B(乙睛) min % % 0. 0 98 2 0.5 98 2 3. 0 93 7 7. 5 60 40 8.0 10 90 10. 0 10 90 13. 0 98 2 c) 流速：0.2mL/min； d) 柱温：30℃； e) 进样量：10μL。 7. 3. 2 质谱参考条件 a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描模式； c) 干燥气温度：325℃； d) 干燥气流量：5L/min； e) 鞘气温度：350℃； 2 NY/T3607—2020 f）鞘气流速：11L/min; g）雾化气压力：45MPa； h）毛细管电压：3500V； i）检测方式：多反应监测模式； j）监测离子对、碰撞能量参见附录B。 7.3.3试样溶液的测定 用液相色谱-串联质谱联用仪测定样品和混合标准工作溶液。以色谱峰面积按外标法定量。在上述 色质谱条件下，8种生氰糖苷（100μg/L)特征离子质量色谱图参见附录C。 7.3.4定性确证 用液相色谱-串联质谱联用仪测定样品和混合标准工作溶液。在相同实验条件下，待测物在样品中的 保留时间与在标准工作溶液中的保留时间偏差在士2.5%以内，并且色谱图中各组分定性离子对的相对 丰度，与浓度接近的标准工作液中相应定性离子对的相对丰度相比，偏差不超过表2规定的范围，则可判 断为样品中存在对应的待测物。 表2定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 8结果计算 试样中生氰糖苷含量的测定结果按式（1）计算。 pxv 1000Xm X (1) 式中： 试样中生氰糖苷类化合物的含量，单位为微克每克（ug/g）； P 由标准曲线求得试样溶液中生氰糖苷类化合物的浓度，单位为微克每升（μg/L）； V—样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； 试样质量，单位为克（g）； f—稀释倍数。 计算结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留至小数点后两位。 9精密度 在重复性条件下获得的2次独立的测试结果的绝对差值不大于这2个测定值的算术平均值的20%。 10其他 本方法木薯中亚麻苦苷、百脉根苷的检出限分别为5.0ug/kg、1.0ug/kg，定量限分别为20.0ug/kg、 5.0μg/kg，亚麻籽中β-龙胆二糖丙酮氰醇和β-龙胆二糖甲乙酮氰醇的检出限为5.0ug/kg，定量限为 20.0μg/kg，竹笋中紫杉氰苷的检出限为5.0μg/kg，定量限为20.0μg/kg，高粱中蜀黍苷的检出限为2.5 ug/kg，定量限为10.0μg/kg，苦杏仁中苦杏仁苷、黑野樱苷的检出限分别为2.0μg/kg、25.0μg/kg，定量 限分别为10.0μg/kg、100.0μg/kg。 3 NY/T3607—2020 附录A （规范性附录） 8种生氰糖苷中英文名称、CAS号、分子式、相对分子量和方法检出限 8种生氰糖苷中英文名称、CAS号、分子式、相对分子量和方法检出限见表A.1。 表A.18种生氰糖苷中英文名称、CAS号、分子式、相对分子量和方法检出限 序号 中文名称 CAS号 分子式 相对分子量 亚麻苦 Hi7 NO6 247.247 2 β-龙胆二糖丙酮氰 CH NOu 409.388 3 百脉根苷 otaustra His 261.274 4 β-龙胆 二糖甲 N 29 NO 423.415 5 紫杉 Taxiphyllin NO 311.29 6 蜀黍甘 99/20-7 311.29 杏仁 Amygdal ANO 457.432 8 黑野樱片 IUNO 295.291 NY/T3607—2020 附录B (资料性附录） 8种生氰糖苷(100μg/L)的保留时间、监测离子对、碰撞能量和裂解电压 8种生氰糖苷(100μg/L)的保留时间、监测离子对、碰撞能量和裂解电压见表B.1。 表B.18种生氰糖苷(100μg/L)的保留时间、监测离子对、碰撞能量和裂解电压 保留时间 定量离子对 定性离子对 碰撞能量 裂解电压 序号 名称 min m/z m/z eV V 亚麻苦苷 270.0/185.1 13 100 1 1.670 (Linamarin) 270.0/243.2 270.0/243.2 13 100 β-龙胆二糖丙酮氰醇 432.2/347.1 28 121 2 2.097 (Linustatin) 432.2/405.1 432.2/405.1 28 121 百脉根苷 284.1/185.1 12 70 3.340 284.1/257.1 (Lotaustralin) 284.1/257.1 12 101 β-龙胆二糖甲乙酮氰醇 446.2/347.1 28 116 4 3.366 (Neolinustat