ICS 65.020.01 B 20 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3564—2020 水稻稻曲病菌毒素的测定 液相色谱-质谱法 Determination of ustiloxins from rice false smut- Liquid chromatography-mass spectrometry 2020-03-20发布 2020-07-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3564—2020 前 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口 本标准起草单位：农业农村部稻米及制品质量监督检验测试中心、中国水稻研究所、国家农业检测基 准实验室（重金属）。 本标准主要起草人：曹赵云、牟仁祥、林晓燕、杨欢、马有宁、陈铭学、朱智伟。 I NY/T3564—2020 水稻稻曲病菌毒素的测定液相色谱-质谱法 1范围 本标准规定了稻曲病菌毒素A、稻曲病菌毒素B、稻曲病菌毒素C、稻曲病菌毒素D和稻曲病菌毒素 F的液相色谱质谱测定方法 本标准适用于稻米和稻曲球中上述5种稻曲病菌毒素含量的测定。 本方法定量限参见附录A。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）近 GB/T6682 RE 3原理 试样用水提取， 提取沟用阳离子交换市相萃取柱净化液相色谱质谱联 仪测定 根据色谱保留时间 和质谱碎片及其离 丰度比 定性，外标法定量 4试剂和材料 A R 除另有规定 ，所用试 4.1甲醇(CH3 HCAS ：6756-1：色谱 4.2甲酸(HCOC H.CA ：64-18-6 4.3二氯甲烷 2CDGA 1S号：75-09-2 4.410%甲醇溶液 吸取 100ml 4.50.1%甲酸溶液 吸取 mL 4.65%甲酸溶液 吸 最 电酸 2加水至 4.75%氨水甲醇溶 吸取5. NH3 HO 6加甲 4.1)至100mL。 4.8标准品（纯度均≥ 012SCAS号：143557-93-1 4.8.2稻曲病菌毒素B(ustiloxinB,C2H3gN,@S,CAS号：151841 4.8.3稻曲病菌毒素C(ustiloxin N.O1.S,CAS号.15 98-7)。 4. 8. 4稻曲病菌毒素 D(ustiloxin D,C23 H34N,O.,CAS号:158243-18-6)。 4.8.5稻曲病菌毒素F（ustiloxinF,C2H3oN,Og，CAS号：1013210-43-9）。 4.9标准溶液配制 4.9.1标准储备液：准确称取10mg（精确至0.01mg)各稻曲病菌毒素标准品（4.8），分别用甲醇溶液 （4.4)溶解并定容至10mL，配成浓度为1000mg/L的标准储备溶液，于一18℃以下保存，有效期12 个月。 4.9.2混合标准储备液：分别吸取一定量的5种标准储备液（4.9.1），用甲醇溶液（4.4)稀释成浓度为10 mg/L的混合标准储备液，于一18℃以下保存，有效期6个月。 4.9.3混合标准工作溶液：用甲酸溶液（4.5)将混合标准储备液（4.9.2）稀释成浓度为2.0μg/L、5.0 μg/L、10μg/L、25μg/L和50μg/L的混合标准工作溶液，现用现配。 1 NY/T3564—2020 4.10固相萃取小柱：聚合物阳离子交换柱，200mg/6mL。使用前依次用3mL甲醇（4.1)和3mL甲酸 溶液（4.6)活化，保持柱体湿润。 4.11微孔滤膜：0.22μm，水相。 4.12液氮。 5仪器和设备 5.1液相色谱质谱联用仪：配电喷雾离子源（ESI)。 5.2分析天平：感量为0.01mg、1mg和10mg。 5.3均质器：转速不低于15000r/min。 5.4超声波清洗器。 5.5谷物粉碎机。 5.6组织研磨仪。 5.7离心机：转速不低于5000r/min。 5.8氮吹浓缩仪。 5.9涡旋振荡器。 6试样制备 6.1稻米样品 净的盛样袋内，备用。 6.2稻曲球样品 取稻曲球样品，加液氮冷冻后，用组织研磨仪（5.6）磨细，混匀，总量不少于10g，装人洁净的盛样袋 内，于一18℃以下保存，备用。 7分析步骤 7.1提取 7.1.1稻米样品 称取5g稻米试样（精确至0.01g）于250mL离心管中，加入50mL水，用均质器在15000r/min匀 浆1min，室温下超声提取10min，加人20mL二氯甲烷，剧烈振荡1min，将离心管放入离心机，在5000 r/min离心5min，准确吸取5mL上清液于10mL容量瓶中，加人0.5mL甲酸（4.2），用水定容至刻度， 混匀，待净化。 7.1.2稻曲球样品 称取0.25g稻曲球试样（精确至0.001g）于250mL离心管中，加人50mL水，用均质器在15000r/min 匀浆1min，室温下超声提取10min，加人20mL二氯甲烷，剧烈振荡1min，将离心管放人离心机，在 5000r/min离心5min。准确吸取1mL上清液至10mL容量瓶中，加人0.5mL甲酸（4.2），用水定容 至刻度，混匀，待净化。 7.2净化 吸取5.0mL待净化液（7.1)全部通过固相萃取小柱（4.10），依次用3mL甲酸溶液（4.6)和3mL甲 醇（4.1)淋洗，弃去所有流出液。用5mL氨水甲醇溶液（4.7)分2次洗脱，收集洗脱液，于50℃水浴中氮 吹至近干，残余物用1.0mL甲酸溶液（4.5)溶解，漩涡混匀，过微孔滤膜（4.11)，待测。 7.3测定 7.3.1液相色谱质谱参考条件 7.3.1.1液相色谱参考条件 2 NY/T3564—2020 a) 色谱柱：反相Cig色谱柱（3.5μm，150mmX2.1mm），或相当者； b) 流动相及梯度洗脱条件见表1； c) 流动相流速0.15mL/min； d) 柱温：30℃； e) 进样量：5μL。 表1流动相及梯度洗脱参考条件 时间，min 0.1%甲酸溶液，% 甲醇，% 0.0 90 10 5. 0 90 10 20.0 20 80 20.1 100 25.0 100 25. 1 10 35.0 10 7.3. 1. 2 质谱参考条件 a) 离子化模 b) 扫描方 离子扫# c) 喷雾电 00 电压 d) 离子源温度：350℃ e) 检测 多反应 监测MRM (J 鞘气厂 0M P: g) 辅助 量 /min; h) 碰撞 i) 离子伟 管温度 ji) 其他质 条件 7.3.2标准曲线 取稻曲病菌 按浓度由低到高依次进样测定 色谱峰面积和浓 度作图，得到标准 U 7.3.3定性测定 对标准溶液及样液均 7.3. 质保留时间与标准溶 液保留时间的偏差不超过标准溶液保留时问的士2 6.且在扣除肯景后的样品 谱图中，所选择离子全部 出现，同时所选择离子的丰 与标准品对应离 多子的丰度比在充许范围内 选范围见表2），则可判定样 品中存在相应的稻曲病菌毒素 种稻曲病菌毒素标准溶液的多反应监测色谱图参见附录B。 表2相对离子丰度的最大允许相对偏差 单位为百分号 相对离子丰度，P >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许的相对偏差 ±10 ±15 ±20 ±50 7.3.4定量测定 取试样溶液进样测定，从标准曲线得到样液中稻曲病菌毒素浓度。 试样溶液中各稻曲病菌毒素的响 应值应均在标准曲线线性范围内；如果超出线性范围，应用0.1%甲酸溶液（4.5）进行适当稀释后进样 测定。 8结果计算 试样中单一稻曲病菌毒素按式(1)计算。 3 NY/T3564—2020 cXViXV? w= (1) V3XmX1000 式中： w 试样中单一稻曲病菌毒素含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c 试液中单一稻曲病菌毒素质量浓度，单位为微克每升（μg/L)； Vi 试液最终定容体积，单位为毫升（mL）； V2 加人提取液体积，单位为毫升（mL）； V3 分取净化液体积，单位为毫升（mL）； m 试样质量，单位为克（g）； f 提取液稀释倍数（稻米样品为2，稻曲球样品为10）； 1000 换算系数。 计算结果保留2位有效数字，当结果大于1mg/kg时保留3位有效数字。 9精密度 9.1在重复性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率)，应符合附录 C的要求。 9.2在再现性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值与其算术平均值的比值（百分率），应符合附录 D的要求。 NY/T3564—2020 附录A （资料性附录） 5种稻曲病菌毒素质谱监测参数及定量限 5种稻曲病菌毒素质谱监测参数及定量限见表A.1。 表A. 1 5种稻曲病菌毒素质谱监测参数及定量限 定量离子对 定性离子对 碰撞能量 透镜电压 定量限 化合物 m/z m/z eV V mg/kg 稻曲病菌毒素A 674.3/209.1 674.3/187.0 29,33 136 0. 005 稻曲病菌毒素B 646.2/181.2 646.2/187.1 33,30 120 0. 005 稻曲病菌毒素C 559.2/207.1 559.2/181.1 28,37 109 0.005 稻曲病菌毒素 D 495.2/192.1 495.2/291.1 20,14 105 0. 000 2 稻曲病菌毒素F 467.2/192.1 467.2/263.1 20,11 102 0.0002 5