ICS 65.020.01 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3258—2018 油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程 Technical code of practice for in vitro identification of resistance to Sclerotinia Sclerotiorum in oilseed rape 2018-07-27 发布 2018-12-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3258—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业农村部农产品质量安全监管司提出。 本标准由农业农村部种植业管理司归口。 本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所 本标准主要起草人：伍晓明、李利霞、陈碧云、闫贵欣、高桂珍 NY/T 3258—2018 油菜品种菌核病抗性离体鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了油菜菌核病抗性离体鉴定方法。 本标准适用于油菜菌核病室内抗病鉴定。 本标准不适用于油菜季节性和形态学( (如无花瓣油菜)避病的抗病鉴定。 2 规范性引用文件 件。凡是不注日期的引 用文件，其最新版本 文件 GB/T 6682 析实 NY/T3068 3 术语和定义 义适用 下列术语 和定 3. 1 油菜菌核病 Selero tinia stem rot of oilseed rape 由病原物核 盘菌S 油菜真 参见附录A)。 3. 2 U 离体人工接 种抗病 ulation atTn dentifi 将器官或 部 分组 发病条件，根 据接种植物器官 部分 3. 3 C 病情指数 反映群体抗性程 式中： DI 病情指数； s 各单株病情级别数值( 、2、3、4); n 对应各病情级别的株数，单位为 N 调查总株数，单位为株； S1 最高病情级别的数值。 3. 4 相对抗性指数 relative resistance index 反映群体较对照群体抗性减轻程度的综合指标，按式(2)计算 (100 - DI RRI = ln( DIck DI (2) 式中: RRI- 相对抗性指数； 1 NY/T 3258—2018 DIck——抗病对照的病情指数; DI一一待评价品种(系)的病情指数。 4试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂 4.1水 GB/T 6682,三级。 4. 21 mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液 称取40.0g氢氧化钠,溶于800mL水中,冷却至室温。 4. 31 mol/L 盐酸(HCI)溶液 量取50mL浓盐酸(36%～38%)加人到体积为450mL的水中,混匀。 4.470%乙醇溶液 量取700mL95%乙醇，加水定容至950mL，混匀。 4.51%次氯酸钠溶液 量取10mL有效氯含量10%的次氯酸钠原液加人到体积为90mL的水中，混匀。 5仪器设备 5.1电子天平 感量 0.01 g。 5.2恒温培养箱 精度士1℃。 5.3人工接种鉴定温室 温度可调节至（22士1)℃，相对湿度可调节至（95士5)%。 6核盘菌接种体制备 6.1核盘菌接种体培养基制备 核盘菌生长培养基用市售马铃薯培养基(PDA,Potato Dextrose Agar)粉剂,按说明书标准用量的 一半，并按每升培养基补加7.5g琼脂粉,加水溶解，定容至1000mL，用1mol/LNaOH或1mol/L HCl溶液调节pH至5.8。之后，将溶液分装到三角瓶中，包扎好后121℃灭菌20min取出，按20mL/ 皿倒平板（直径90mm培养皿），冷却后储存备用。 6.2核盘菌菌核的采集和消毒 从田间直立的油菜菌核病发病植株体内剥离核盘菌菌核，选择颗粒饱满、无裂痕、无霉变的菌核放 人洁净的容器中，带回实验室置于一20℃冰箱备用。在超净工作台上，将菌核置于70%乙醇中浸泡 1min，再转人1%次氯酸钠溶液中浸泡3min,之后用无菌水漂洗3次。 6.3核盘菌菌丝的扩繁 在超净工作台上，将已消毒的菌核切成2mm×2mm(长×宽）的小块。用镊子取一个菌核切块置 于培养皿中心，并使其切面紧贴培养基表面，封皿后（22士1)℃暗培养。萌发菌丝后，4℃保存，并将此培 养基用作菌源。离体接种前5d,用直径5mm的打孔器沿菌源培养基菌丝边缘打孔。将打孔得到的菌 丝块取出置于新的培养基中心，并使菌丝块有菌丝一面紧贴于新的培养基表面,封皿后（22士1)℃暗培 养3d。待菌丝正好长至培养基边缘时，取出按上述步骤扩繁，（22土1)℃暗培养约2d后备用。 7菌核病抗性离体鉴定方法 7. 1 苗期离体叶片鉴定 N NY/T 3258—2018 7.1.1取样 按各地正常播种时间播种待鉴定油菜材料，播种材料应包含抗病对照和感病对照。出苗后8周～ 10周，取健康油菜幼苗从心叶向外数的第2片完全展开叶，正面朝上置于底部铺好湿纱布（纱支：21sX 21s，经纬度：120X100根/100mm）的塑料盒中或接种床上。 7.1.2人工接种 用直径5mm打孔器沿菌丝边缘打孔取菌丝块，用镊子将菌丝块接种于所取叶片中上部并偏离主 叶脉的位置，使菌丝块有菌丝一面紧贴叶片。接种后用水喷雾并用塑料薄膜覆盖保湿，放置于（22士 1)℃、相对湿度（95士5)%的人工接种鉴定温室中培养。每份材料选择30片均匀一致的叶片接种。 7.1.3调查方法 以接种处的水渍边缘作为病斑边缘，接种2d后测量椭圆形病斑长径和短径。大批量鉴定时，调查 病斑顺序,尽量和接种顺序保持一致。调查时，对发病材料的病斑进行图片采集。图片采集时，应放置 参照标尺。整个试验发病情况的调查应在1d之内完成，如有特殊情况应在记录表备注栏中标出，调查 数据及时录入记载中（参见附录B中的B.1)。 7.1.4病斑面积计算 病斑面积按式(3)计算。 S2 = (元Xa Xb) (3) 4 式中： S2——待测材料的病斑面积,单位为平方厘米（cm²）; 待测材料的病斑长径,单位为厘米(cm)； 6— 待测材料的病斑短径,单位为厘米（cm）。 7.2终花期离体茎秆鉴定 7.2.1取样 按各地正常播种时间播种待鉴定材料，播种材料应包含抗病对照和感病对照。在大田材料处于终 花期时，选择正常且长势一致（株高、株型、叶片大小等相似)的植株，截取离地20cm～50cm之间长为 30cm的茎秆，两端用保鲜膜包住保湿，置于底部铺好湿纱布的塑料盒中或接种床上。 7. 2.2人工接种 用直径5mm打孔器沿菌丝边缘打孔取菌丝块，用镊子将菌丝块接种于所取茎秆的两茎节中间位 置，并使菌丝块有菌丝一面紧贴茎秆表面。接种后喷雾并用塑料薄膜覆盖保湿，放置于（22土1）℃、相对 湿度（95土5）%的人工接种鉴定温室中培养，每份材料接种30株。 7.2.3调查方法 以接种处的水渍边缘作为病斑边缘，接种后5d调查病斑长度。在进行大批量鉴定时，调查病斑顺 序尽量和接种顺序保持一致。调查时对发病材料进行图片采集，图片采集时应放置参照标尺。整个试 验发病情况的调查应在1d之内完成，如有特殊情况应在记录表备注栏中标出，调查数据及时录人记载 表中(参见B.2)。 8试验数据处理 如果单株测量值满足式（4），可认为该单株值为异常值，在后续的分析中可予以剔除。 ISi-s>3g (4) 式中： S；一—单株测量值,单位为平方厘米或厘米（cm²或cm); s一—样本平均值,单位为平方厘米或厘米(cm²或cm)； 3 NY/T 3258—2018 样本标准差,单位为平方厘米（cm²)或厘米（cm)。 油菜单株抗性分级 9.1 苗期离体叶片单株抗性分级 根据四分位分类法则,将病害等级分为5级： 0级：无病斑； 1 级: 0<S2≤So.25 (- 分位点值）； 2 级: So. 25<S2≤So. 5(- 分位点值)； 3 级: So.5<S2≤S.75 ( 3 分位点值)； 4 级: So. 75<S2 。 9.2终花期离体茎秆单株抗性分级 根据四分位分类法则,将病害等级分为5级： 0级:无病斑； 2 级:So.25<L<So.5( 3 级: So. s <L≤So. 75 (- 4 级: So.75<L。 10 病情指数和相对抗性指数的计算 根据记录结果和式(1)、式(2)分别计算病情指数和相对抗性指数。 11 抗性评价 对油菜材料的抗性评价根据NY/T3068的规定按照表1的标准进行。 表1油菜菌核病室内离体鉴定抗性评价标准 抗性评价 相对抗性指数(RRI) 高抗(HR) RRI≤-1. 2 中抗(MR) -1. 2<RRI≤-0. 7 低抗(R) 0.7<RRI≤0 低感(S) 0<RR≤0. 9 中感(MS) 0. 9<RRI<2. 0 高感(HS) RRI>2.0 NY/T 3258—2018 附录A （资料性附录） 油菜菌核病 A.1 病原菌 A.1.1学名 中文学名：核盘菌。 拉丁学名:Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary. 分类地位：子囊菌门、盘菌纲、柔膜菌目、核盘菌科、核盘菌属。 A.1.2形态描述 菌核黑色，不规则形，由暗色的皮层和无色的髓部构成；子囊盘生于菌核上，盘状，中央凹陷，具柄； 子实层米色、肉桂色或淡褐色，子层托颜色稍淡于子实层，柄基部暗色；外囊盘被为角胞组织，外层细胞 近球形、椭圆形或长形，细胞纵轴与囊盘被表面垂直；盘下层为交错丝组织，菌丝无色；子实下层发育不 健全，厚15μm～30μm；子实层厚127um～150um；子囊近圆柱形，具8个子囊孢子；子囊孢子椭圆形至 近梭形,无色,单细胞,在子囊中单列排列。 A. 2 病害症状 油菜叶片感病后初生暗青色水渍状斑块