ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3235—2018 羊传染性脓疱诊断技术 Diagnostic techniques for contagious ecthyma 2018-05-07 发布 2018-09-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3235—2018 前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业农村部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院、吉林省动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：邵洪泽、付殿国、王楠、程荣华、柴方红、于钦磊、董航、呼延含蓉、郭衍冰、孙强、 李昱洁、刘沂霖、石春军、陆秀娟。 I NY/T 3235—2018 引言 羊传染性脓疱，又称羊接触传染性脓疱皮炎（俗称羊口疮），是由痘病毒科副痘病毒属的传染性脓疱 病毒引起绵羊、山羊的一种急性接触传染性、嗜上皮性的人兽共患病。以在口、唇、舌、鼻、乳房等部位的 皮肤和黏膜形成丘疹、水疱、脓疱、溃疡及结成疣状厚痴为特征。羔羊最为易感，常引起群体发病。我国 将其列为三类动物疫病。 本病最早于1920年发现于欧洲，现已广泛分布于全世界。我国新疆、甘肃、青海、内蒙古以及东北 三省等养羊地区均有本病发生和流行的报道。发病率30%～50%，羔羊死亡率高，可达20%。该病为 人兽共患病，人主要通过皮肤擦伤而感染。 OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》中未见羊传染性脓疱相关诊断标准。 本病确诊可采用病毒分离培养或对病料进行负染色直接进行电镜观察,还可用血清学方法诊断，如中和 试验等。另外,聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光定量PCR可快速检测本病的病原。 Ⅱ NY/T 3235—2018 羊传染性脓疱诊断技术 1 范围 本标准规定了羊传染性脓疱的临床诊断、样品的采集和处理、病毒分离培养、动物接种试验、电镜形 态学观察、聚合酶链式反应(PCR）、实时荧光定量PCR和综合判定方法。 本标准适用于羊传染性脓疱的诊断 2规范性引用文件 下列文件对于本文件 的应用 件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的孕 用文 文件 GB/T 6682 析实 GB 19489 GB/T 2740 验室质 艺制规 3 生物安全措施 S 所有培养物禾 废弃物 RA 4 防污染措施 防止污染措 施应 实验室应根 居实验 的 设备、 、物品混用；每一个 区域应有专用的 义器设 CENT 5临床诊断 C 5.1 流行病学 5.1.1病羊和带 5.1.2易感羊经 支肤 乳母羊常因羔羊 乳而发生乳头擦伤，导 于感染 5.1.3绵羊和山羊易感染 以3月龄 发疗 5.2 临床症状 5.2.1潜伏期4d～7d。病羊常在口角、上唇或鼻镜上出现散在的小红斑点,并迅速变为丘疹,继而发 展成水疱或脓疱。水疱或脓疱破裂后形成黄色或 色的疣状硬咖(参见附录A中的A.1)。 5.2.2病羊良性经过时，硬痴增厚、干燥，并于1周～2周内脱落而恢复正常。 5.2.3严重病例的患部继续发生丘疹、水疱和脓疱，痴皮互相融合，波及整个口唇周围及颜面和眼脸。 可形成大片具有龟裂并易出血的污移痴垢，呈桑葚状或花椰菜状，痴下肉芽增生(参见A.2)。严重影响 羊采食，以致日渐消瘦，并可导致死亡。病程可长达2周～3周。 5.2.4口腔黏膜也常出现水疱、脓疱和烂斑，恶化时可形成大面积溃疡， 5.2.5母羊乳头病变与口唇相似，但痴皮稍薄。 5.2.6有时在蹄叉、蹄冠部皮肤上出现水疱、脓疱，破裂后形成污移溃疡 5.3病理变化 NY/T 3235—2018 口唇、蹄及外阴等处黏膜形成丘疹、水疱、脓疱、溃疡与疣状痴，组织上皮高度增生、变性、角化、坏死 及表皮细胞浆中有嗜酸性包涵体形成。 6样品的采集和处理 6.1材料 6.1.1仪器 6.1.1.1电子天平。 6.1.1.2研磨器。 6.1.1.3低温高速离心机。 6.1.1.4冰箱。 6.1.1.5可调微量移液器：200μL~1000μL、20μL～200μL。 6.1.2耗材 6.1.2.1吸头:1000μL、200μL。 6. 1. 2. 2 Eppendorf 管:1. 5 mL、0. 5 mL、0. 2 mL 6.1.2.3棉签。 6.1.3试剂 6.1.3.1除有特殊说明外，所用试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 6.1.3.20.01mol/LPBS液:含青霉素2000IU/mL、链霉素2000mg/mL,pH7.0~7.2。 6.2 方法 6.2.1痴皮 采集病羊的口、唇、乳房等部位的痴皮1g,置于放有干燥剂(硅胶或其他干燥剂)的灭菌烧杯中，置 冰盒内送检。将痴皮剪碎、研磨，置于4mL的0.01mol/LPBS缓冲液（含青霉素2000IU/mL、链霉素 2000mg/mL，pH7.0～7.2),重悬。4℃浸渍16h～20h，以3000r/min离心10min，取上清液。 一20℃保存备用。 6.2.2水疱液 采集未破裂的丘疹水疱液，置于2倍体积的0.01mol/LPBS缓冲液（含青霉素2000IU/mL、链霉 素2000mg/mL，pH7.0～7.2)的灭菌试管中，置冰盒内送检。样品3000r/min离心10min，取上清 液。一20℃保存备用。 7 病毒分离培养 7.1材料 7.1.1仪器 7.1.1.1低温高速离心机。 7.1.1.2生物安全柜。 7.1.1.3CO2培养箱。 7.1.1.4倒置显微镜。 7.1.1.5冰箱。 7.1. 1.6 可调微量移液器:200μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL。 7.1.2耗材 7. 1.2. 1 吸头:1 000 μL、200 μL、20 μL、10 μL。 2 NY/T 3235—2018 7. 1. 2. 2 Eppendorf 管:1. 5 mL、0. 5 mL、0. 2 mL。 7.1.2.375 cm²细胞培养瓶。 7.1.3试剂 7.1.3.1除有特殊说明外，所用试剂均为分析纯；试验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 7.1.3.2MEM细胞培养液。 7.1.3.3胎牛血清：56℃灭活30min。 7.1.3.4细胞营养液：90%MEM，10%胎牛血清（含青霉素100IU/mL和链霉素100mg/mL， 0.03g/mL谷氨酰胺，用75g/LNaHCO3溶液调pH至7.0～7.2）。 7.1.3.5细胞维持液：98%MEM,2%胎牛血清（含青霉素100IU/mL和链霉素100mg/mL， 0.03g/mL谷氨酰胺,用75g/LNaHCO：溶液调pH至7.0～7.2）。 7.1.4细胞 B. 3。 7.2方法 7.2.1按附录B制备任一一种单层细胞，待细胞长成良好的单层后（参见A.3)。 7.2.2倒掉细胞营养液，接种6.2制备病毒液样品1.0mL,37℃吸附1h。 7.2.3将病毒液倒出，加人细胞维持液10mL，置37℃、5%CO2培养箱培养。 7.2.4每天观察细胞变化，连续观察5d。如接毒后1d～5d内细胞出现变圆、肿胀，细胞间质增宽，折 光性增强，细胞团聚、脱落等细胞病变效应(CPE),且病变达70%～80%时收获病毒液（参见A.4);将病 变细胞培养液反复冻融3次，一20℃保存备用。如果盲传3代无细胞病变效应（CPE)，则判为病毒分离 阴性。 8动物接种试验 8.1试验程序 取7.2制备样品0.2mL，划痕接种临床健康3月龄～5月龄羔羊唇黏膜， 8.2结果判定 若接种后 3d～4 d出现划线红肿,5d～7d出现水疱或脓疱等典型的临床症状,接种试验为阳性。 若无临床症状,则判为阴性。 9电镜形态学观察 9.1材料 9.1.1仪器 9.1.1.1低温高速离心机。 9.1.1.2生物安全柜 9.1.1.3电镜。 9.1.1.4可调微量移液器：20μL~200μL。 9.1.2耗材 9.1.2.1普通平皿。 9.1.2.2滤纸。 9.1.2.3吸头：200μL。 3 NY/T 3235—2018 9.1.2.4 Eppendorf 管:1.5 mL。 9.1.2.5支持网。 9.1.3 试剂 2%磷钨酸溶液:pH6.8。 9.2方法 取病变细胞培养液反复冻融3次后，3000r/min离心10min，弃大部分上清液，留少量上清液重 悬。吸少量沉淀悬液或者6.2制备样品，直接滴在支持网上，悬液在网上呈半球形。2min～3min后， 用一片干净滤纸从网边吸去液体。再滴磷钨酸染液在网上，染色1min。用滤纸吸去染液，立即进行电 镜观察或置干燥器内短期保存。 9.3结果判定 透射电镜观察，病毒大小约为280nmX140nm，表面呈规则的网状结构。网状结构有规则地斜向 平行地沿着病毒颗粒长轴呈“8”字缠绕的毛线团样。若发现毛线团样特殊表面结构的病毒粒子（参见 A.5)可判为电镜形态学观察为阳性，未观察到则判为阴性。 10聚合酶链式反应(PCR) 10.1材料 10.1.1仪器 10.1. 1.1 PCR 仪 10.1.1.2低温高速离心机。 10.1.1.3电泳槽。 10.1.1.4电泳仪。 10.1.1.5紫外线灯或紫外凝胶成像仪。 10. 1. 1. 6 5冰箱。 10.1.2耗材 10.1.2.1 吸头:1000μL、200 μL、20 μL、10 μL。 10. 1. 2. 2 Eppendorf 管:1. 5 mL、0. 5 mL、0. 2 mL。 10.1.3试剂 10.1.3.1除有特殊说明外