ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3234-2018 牛支原体PCR检测方法 PCR method for detection of Mycoplasma bovis 2018-05-07 发布 2018-09-01实施 中华人民共和国农业农村部‧发布 NY/T 3234—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业农村部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、华中农业大学、中国动物卫生与流行病学 中心。 本标准起草人：辛九庆、李媛、郭爱珍、宋建德、王岩。 I NY/T 3234—2018 引言 牛支原体(Mycoplasmabouis,Mbouis)在分类上属于支原体目支原体科支原体属成员。虽然该病 原于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到，但一直被认为是小反动物支原体一一无乳支原 体(Mycoplasmaagalactiae,Magalactiae)的一个亚种，直到1976年才被命名为牛支原体。 牛支原体是一种多形性的微生物，外观呈球形、星状、丝状，大小为（125～150）μm×（0.2～ 0.8）μm,缺少细胞壁。能通过450nm滤膜,压挤下能通过220nm滤膜,与原生质体相似,但对渗透性 溶胞作用有较强的抵抗力,并且在原生质体溶解的条件下还能存活。其基因组大小约为1 Mbp,G十C 含量为29.76%。 牛支原体已经在北美洲和欧洲等地广泛流行，并造成了严重的经济损失。主要引起牛的肺炎、关节 炎、乳房炎、中耳炎等，有时也会引起角膜结膜炎、子宫内膜炎、输卵管炎、卵巢炎、流产和精囊炎。这些 常见的疾病被统称为牛支原体相关疾病(Mycoplasma bouis-associated disease,MbAD)。该病原已经 随着动物贸易的发展扩散到世界各地。 2008年，我国首次从患有肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体，目前已经广泛流行于全国各地，威胁 着我国的养牛业，并造成了巨大的经济损失。由于其临床表现和病理剖检变化与牛传染性胸膜肺炎（牛 肺疫）相似，必须进行实验室诊断才能最终确诊。 Ⅱ NY/T 3234—2018 牛支原体PCR检测方法 1 范围 本标准规定了牛支原体PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于实验室对牛肺组织、菌液培养物的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 GB19489 实验室生物 安全通 3仪器与试剂 3.1仪器 3.1.1台式高速离心机： 最大禽心 应不低 S 3. 1. 2 1.5mL离心管。 3. 1. 3 生物安全柜 超净土 作台 3. 1. 4 PCR扩增仪及 与其配 勺0:2 TUR 3.1.5振荡混匀器 3.1.62℃~8℃冰箱 3. 1.7 电泳仪、电 泳 3.1.8 可调微量移液 3.2试剂 3.2.1电泳缓冲液(T 方法见附录 3.2.2DNA分子量标 3.2.3除特殊说明外，所 剂均 析红 3.3引物及引物配制 上游引物：5'-TTTTAGC TTTTTC GAAC 下游引物:5'-GGCTCTCATTAAGAATGTC 引物用灭菌去离子水稀释至10μl L 备用。 3.4牛支原体阳性样品及阴性样品的制备 以灭活前浓度为108CCU/mL的牛支原体菌液培养物（由指定单位提供）,经PCR检测无乳支原 体、丝状支原体和精氨酸支原体均为阴性后作为标准阳性样品；以健康牛肺脏样品（PCR检测牛支原体 阴性)为标准阴性样品；以灭菌ddH2O作为空白样品。 4样品采集与处理 4.1样品采集 选取有明显病变和健康交界处组织,无菌采集病牛肺脏,剪成 3 cm～5 cm 方块送实验室备用。 1 NY/T 3234—2018 4.2样品处理 取0.5g待检样品(肺脏)于已洗净、灭菌并烘干的匀浆器中充分研磨,加10mL灭菌生理盐水混 匀，反复冻融3次，3000r/min离心15min。取上清液转人无菌的1.5mLEppendorf管中，编号备用。 PCR试验中阳性对照样品使用3.4中的牛支原体菌液培养物 样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24 h。若需长期保存,应放在一70℃冰箱或液氮中，但应避 免反复冻融。 5操作方法 5.1 基因组 DNA的提取 在样本制备区进行,有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B。 使用市售的DNA提取试剂盒提取组织、培养物种的DNA,具体操作参照试剂盒说明。 5.2 PCR反应所用引物 使用3.3中配制好的引物溶液。 5.3 PCR 反应体系及反应条件 配置PCR反应体系在反应混合物配制区进行；加样在样本处理区进行。 PCR体系如下所示： 10 XPCR Buffer(Mg2+ free) 2.5 μL 25 mmol/L MgCl2 2. 0 μL 2. 5 mmol/L dNTPs 2. 0 μL 上游引物(10μmol/L) 0.5μL 下游引物(10μmol/L) 0.5 μL 5U/μL rTaqDNA聚合酶 0.5 μL 模板DNA 2. 0 μL 补ddH,O至总体积(Total) 25.0 μL 瞬时离心，置PCR扩增仪内进行扩增。95℃预变性5min；循环95℃30s，52℃30s，72℃120s，30 个循环后72℃延伸10min。 5.4产物检测 使用0.8%琼脂糖凝胶在含有染料(EB或其替代物)的TAE缓冲液中进行电泳,在紫外观察仪或 者凝胶成像系统观察结果。 6 结果判定 6.1试验成立的条件 标准阳性样品扩增出1.9kb片段而空白对照不能扩增出任何条带，则PCR反应判定为试验成立； 如标准阳性样品不能扩增出目的大小片段，或空白样品和标准阴性样品扩增出目的片段，则试验不成 立。 6. 2 2检测结果判定 符合6.1的条件下，待检样品扩增出的DNA片段为1.9kb，可判定待检样品为牛支原体核酸阳 性；未出现1.9kb的DNA片段,则可判定待检样品为牛支原体核酸阴性。PCR检测结果判定标准图 例见附录C。 若需进一步确定,可对PCR产物进行测序。 2 NY/T 3234—2018 附录A （规范性附录） 相关试剂的配置 A. 1电泳缓冲液(TAE) A. 1. 1 50 ×TAE储存液 分别量取 NazEDTA-2H,O 37. 2g、冰醋酸 57.1 mL、Tris-Base 242 g,用一定量(约 800 mL)的灭 菌双蒸水溶解。充分混匀后,加灭菌双蒸水补齐至1000mL。 A. 1.2TAE使用液 取10mL储存液加490mL蒸馏水即可。 A. 20. 8%琼脂糖凝胶 将0.8g琼脂糖干粉加到100mLTAE使用液中,在沸水浴或者微波炉内加热至琼脂糖熔化形成 凝胶。待凝胶稍冷却后加人EB或替代物，终浓度为0.5μg/mL。 A.3磷酸盐缓冲液(PBS) 将 8. 0 g NaCl、1. 44 g NazHPO4、0. 2g KCl、0.24 g KHzPO4 于 800 mL去离子水中完全溶解,用 HCl调 pH至 7.4,加去离子水定容至1000 mL,高压灭菌后储存备用。 3 NY/T 3234—2018 附录B (规范性附录) 检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施 B.1样品处理和核酸制备 按照GB19489的要求,样品处理应在符合要求的分子生物学检测室中进行,并且严格执行有关的 生物安全要求，穿实验服，戴 次性手套、 套要经常更换。 提取 DNA过程或 PCR HING 专用区域。 B.2 PCR 检测过程 B.2.1可用10%次氯酸钠溶液 擦拭工作台面 意保 面和环境 B.2.2抽样和制样工 套清洁工具仅限于 个样品使用。 存放 （样品的） 容器应该经过清洗灭菌或为一次性灭菌容器。 B.2.3扩增前 T应检查各PCR管盖是否盖紧对于采）用热盖加热（PCR管中不 仪除要注意检 查各 PCR管 一致，以保 有PCR 证热盖可以压 紧所 反应管 B.2.4 PCR实验 、PCR反应液配 制、PCR循环扩增 及PCR 区” 到“脏区”单 方向进行。 B.2.5所有的试剂 用不得 GRI 人 4