ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3188—2018 鸭浆膜炎诊断技术 Diagnostic techniques for duck serositis 2018-03-15 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3188—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所 本标准主要起草人：郑福英、刘永生、陈启伟、宫晓炜。 I NY/T 3188—2018 引言 鸭浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）引起的一种鸭的接触性传染病，又称为 新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合征、鸭疫巴氏杆菌病等。该病多见于 1 周龄～8 周龄的维鸭,呈急性或慢性 败血症，临诊上主要表现为精神沉郁,采食量下降，眼和鼻分泌物增多,头颈震颤或歪斜,共济失调。剖 检眼观病变为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎,部分病例出现关节炎，常引起维鸭大批发病和死亡，目 前已成为危害鸭养殖业的一种最常见的细菌病。 鉴于目前我国关于鸭传染性浆膜炎的标准化诊断技术还是空白,因此我们制定了该标准,以便有效 地诊断和监控该病。 Ⅱ NY/T 3188—2018 鸭浆膜炎诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭浆膜炎的临床诊断和实验室诊断技术要求。 本标准适用于鸭浆膜炎的诊断。 2规范性引用文件 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包扌 GB 19489实验室 NY/T 541 兽医诊断样品采集 3生物安全措施 进行鸭浆膜炎 炎实 验室诊断 时，如细菌分 B/T 194 样品采集、 保存与运输按照 NY 的规定执行 4临床诊断 4.1流行特点 4.1.11周龄 周龄的甲 均易感，但以2周龄 龄的雏鸭量 4. 1. 2 本病主要经 东口感染面 4.1.3饲养管理不 龙过热 、微量元素或蛋 白质等均可诱发该病 4.1.4 本病的感染率 ，患病鸭的死亡率从5 4. 2 临床症状 4. 2. 1 急性病例 4.2.1.1多见于2周龄 周龄维鸭。 4. 2. 1. 2 病鸭表现为倦急,缩颈,不愿走动或行动迟缓,采食量下降。 4.2. 1.3 眼、鼻有分泌物。 4. 2. 1. 4 濒死前出现神经症状,头颈震颤,角弓反张,不久抽搐而死 4. 2. 1. 5 病程一般 1 d~3 d。 4. 2. 2 慢性病例 4.2.2.1多见于4周龄～7周龄的鸭。 4.2.2.2病鸭精神沉郁,食欲降低。 4.2.2.3病鸭共济失调,痉挛性点头或摇头摆尾,前仰后翻,呈仰卧姿态,有时头颈歪斜,做转圈或倒退 运动，最后衰竭死亡。 4.2.2.4病程达1周或1周以上。 4.3剖检病变 4.3.1纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎。 1 NY/T 3188—2018 4.3.2慢性病例常见胫跖关节及关节肿胀，切开见关节液增多 4.4结果判定 符合4.1中的某些流行特点,病鸭出现 4.2中的临床症状和4.3中的眼观病变,可判断为疑似鸭浆 膜炎。 5实验室诊断 5.1样品采集与运输 5.1.1样品采集 5.1.1.1样品数量 每个发病鸭群最少选择5只病鸭采集样品。 5.1. 1.2 血清 选择具有临床症状的活鸭,从颈静脉或翅静脉无菌采集血液 1 mL～2 mL,用常规方法分离血清。 5.1.1.3组织 若为活鸭，从颈动脉放血处死,无菌采集其脑、心脏和肝脏组织,分别放人无菌带有螺旋盖的离心管 中。若为死亡鸭,则直接无菌采集其脑、心脏和肝脏组织。 5.1.2样品的运输与储存 5.1.2.1样品采集后，置于冰上冷藏送至实验室。 5. 1.2.2 血清和病料组织冻存于一20℃以下。 5.2鸭疫里默氏杆菌分离鉴定 5.2.1仪器 电子天平，光学显微镜，组织破碎仪，低温高速离心机，恒温培养箱。 5.2.2耗材 载玻片，枪头，无菌2mL和5mL离心管，一次性培养血。 5.2.3试剂 灭菌双蒸水或去离子水，胰蛋白陈大豆培养基，胰蛋白陈大豆琼脂培养基，绵羊抗凝血，小牛血清， 商品化细菌生化鉴定管,磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/L，pH7.2)。相关试剂配制方法见附录A。 5.2.4样品处理 5.2.4.1无菌取鸭的脑、心脏、肝脏组织0.5g~1g,分别放人5mL容量的无菌离心管中,在天平上称 量所取病料组织的重量(离心管的重量在加人组织前已经称量）。 5.2.4.2以2mL/管加入PBS(0.01mol/L,pH7.2),以50Hz在组织破碎仪内研磨3min。 5.2.4.3吸取100μL组织混悬液,放入2mL容量的无菌离心管中,用适量PBS(0.01mol/L,pH7.2) 稀释至1：10（w/），混匀后取100μL作为接种材料。 5.2.5细菌分离 养箱中，37℃培养20h~24h。 5.2.5.2挑取疑似鸭疫里默氏杆菌的单菌落接种到3mL胰蛋白陈大豆肉汤（含5%小牛血清）中， 37℃、200r/min振荡培养8h~10h。 5.2.5.3用接种环蘸取少量菌液，划线接种于胰蛋白陈大豆琼脂(含5%小牛血清)平板上，再置于5% CO2培养箱中，37℃培养20h24h。 5.2.5.4挑取符合鸭疫里默氏杆菌菌落特征的单菌落，再次接种到3mL胰蛋白陈大豆肉汤（含5%小 牛血清）中,37℃、200r/min振荡培养8h～10h。 2 NY/T 3188—2018 5.2.5.5如5.2.5.3,再次划线接种于胰蛋白陈大豆琼脂(含5%小牛血清)平板上并培养。 5.2.5.6得到的菌落形态眼观一致,用革兰氏染色后观察到的菌体形态一致，视为得到纯化菌株。 5.2.6细菌形态观察 5.2.6.1菌落特征 无色、半透明、光滑、湿润、微隆起、呈露珠状、直径0.5mm~1mm。 5.2.6.2革兰氏染色镜检 革兰氏阴性小杆菌,多单个存在,少数成双,偶尔呈链状排列,可形成荚膜，无芽孢,无鞭毛。 5.2.7细菌生化鉴定 5.2.7.1细菌生化鉴定管中提前添加5%小牛血清，保证鸭疫里默氏杆菌良好的生长状态。 5.2.7.2一般菌株不分解葡萄糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、蕈糖、乳糖、半乳糖和棉子糖;少数菌株 发酵甘露糖和麦芽糖。不能利用山梨醇、肌醇、卫茅醇、甘露醇。 5.2.7.3不能利用水杨苷和西蒙氏枸檬酸盐。 5.2.7. 4 明胶液化试验、鸟氨酸脱羧酶活性试验、硝酸盐还原试验、甲基红试验、V-P 试验均为阴性。 5.2.7.5不产生吲哚和硫化氢。 5.2.7.6氧化酶、触酶试验阳性。 5. 2. 8细菌鉴定 符合菌落特征,革兰氏染色阴性,并且符合生化反应特性的菌株,按照5.3做进一步鉴定。 5.2.9结果判定 菌落特征明显,革兰氏染色阴性,符合生化反应特性的菌株,如果5.3鉴定结果阳性,则判定为鸭疫 里默氏杆菌分离阳性。否则,判定为未检出鸭疫里默氏杆菌。 5.3PCR检测方法 5.3.1仪器 PCR热循环仪,核酸电泳仪和电泳槽，全自动凝胶成像系统。 5.3.2耗材 PCR反应管，移液器，枪头。 5.3.3试剂 灭菌双蒸水或去离子水,组织 DNA 提取试剂盒,2X PCR反应预混酶,DL2000 DNA 分子质量标 准,琼脂糖,1倍TAE缓冲液,引物(PAGE纯化，上下游引物浓度分别配成20pmol/μL)。相关溶液的 配制方法见附录B。 可以采用引物1119F/1119R用于鸭疫里默氏杆菌核酸的检测,引物的靶基因、序列和扩增产物的 大小见表1。 表 1PCR 检测鸭疫里默氏杆菌核酸的引物 引物 目的 靶基因 序列（5'-3'） 产物大小 1119F 正向引物 外膜蛋白A(OmpA)基因 ATGTTGATGACTGGACTTGGT 1 119 bp 1119R 反向引物 外膜蛋白A(OmpA)基因 CTTCACTACTGGAAGATCAGA 5.3.4样品处理 5.3.4.1胰蛋白陈大豆琼脂(含5%绵羊血)平板上的单克隆菌落,胰蛋白陈大豆肉汤菌液,均可以直 接作为DNA模板。 5.3. 4.2用组织 DNA提取试剂盒从鸭的脑、心脏、肝脏组织中提取总 DNA,提取步骤按照说明书进 行。提取到的DNA冻存于一20℃，作为模板备用。 3 NY/T 3188—2018 5.3.5 PCR 反应 5.3.5.1对照设置 每次进行PCR反应时均设置阳性对照和阴性对照。以鸭疫里默氏杆菌 CVCC3966 株作为阳性对 照菌株，多杀性巴氏杆菌CVCC453株作为阴性对照菌株。 5.3.5.2反应体系 50μL/管，包括2×PCR反应预混酶25uL,1119F和1119R引物各1μL(引物终浓度为0.4pmol/ μL),无菌去离子水 18μL,模板 5μL。 5.3.5.3PCR 扩增程序 94℃ 5 min,35 个循环(94℃ 30 s,51℃ 60 s,72℃ 90 s),最后 72℃ 10 min。 5.3.6PCR产物的电泳 PU.BI 行电泳，以100mA 电泳 校成像系统多 保存 5.3.7结果判定 Q 阳性对照出现 条19 增条带,阴性对照无 9. bp 带，说明试验成立。被检样 品出现一条 119 PCR 果阳 1119bp的扩 PCR结果阴性,表述为未检出鸭疫里默氏杆 6综合判定 JRA 凡具有 5 中任何 U