ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3179—2018 甘蔗脱毒种苗检测技术规范 Technical specification for the certification of sugarcane pathogen-free planting stock 2018-03-15 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3179—2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国农作物种子标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室/国家甘燕工程技术 研究中心、全国农业技术推广中心、中国热带农业科学院热带生物技术研究所。 本标准主要起草人：许莉萍、阙友雄、方晓东、周泽宇、张树珍、苏亚春、陈常兵、高世武、杨本鹏、郭晋 隆、吴期滨、王恒波。 I NY/T 3179—2018 甘蔗脱毒种苗检测技术规范 1 范围 本标准规定了甘蔗脱毒种苗等的术语和定义、检测对象、抽样、检测方法和检测结果判定 本标准适用于甘蔗宿根矮化病菌、甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗条纹花叶病毒和甘蔗黄叶病 毒的检测以及甘蔗脱毒种苗的抽样和检定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。 NY/T2679甘蔗病原菌检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3. 1 脱毒种苗pathogen-free planting stock 经腋芽、茎尖或其他等甘蔗材料培养、繁殖或蔗茎温水处理而获得的符合相关质量要求的蔗苗（包 括瓶苗、袋苗、袋栽苗、杯苗、穴盘苗、无琼脂苗或裸根苗等)或种茎(包括原种、基础种和生产用种以及经 温水处理等途径获得的各类种苗）。 3. 2 原种 primary seed 在甘蔗种苗脱毒体系中，经对检测对象进行检测合格的组培苗；或由该组培苗种植田间并经6个 月～9个月生长采收后的种茎，要求30条主茎平均有效节不超过16节， 3. 3 基础种 secondary seed 过16节。 3. 4 生产用种 commercial seed 以基础种为种苗，种植田间并经6个月～9个月生长采收后的种茎，要求30条主茎平均有效节不 超过16节。 4检测对象 4.1甘蔗宿根矮化病菌(Leifsoniaaylisubsp.ayli,Lxx)。 4.2甘蔗花叶病毒（Sugarcanemosaic virus,SCMV)。 4.3高梁花叶病毒(Sorghummosaic virus,SrMV)。 4.4甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)。 4.5甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellowleaf virus,SCYLV)。 1 NY/T 3179—2018 5抽样 5.1抽样方法 按照“五点取样法进行，示意图见图1。各点取样数量一致，单行连续取样，不同甘蔗品种或不同 类型(如原种各种形式的小苗、田间繁殖的原种种茎等)的种苗均需独立抽样。 图1五点取样法 5.2抽样数量 危害性病害甘蔗黑穗病的发生率根据表型调查来确定，无论面积大小，每点调查100株，5个取样 点共调查500株。各类蔗苗（如瓶苗、袋装苗、袋栽苗、杯苗、穴盘苗、无琼脂苗或裸根苗等)以瓶、袋、株 为单位，其中瓶苗以瓶为单位，袋装苗以袋为单位，袋栽苗、杯苗、穴盘苗、无琼脂苗或裸根苗以株为单 位；田间种植的种苗以公顷(hm²)为单位,各类种苗目标病原检测的抽样数量见表1。 表1不同类型种苗的抽样数量 种苗类型 种苗数量 抽样数量，瓶/株 ≤1000瓶/株 15 1001瓶/株~5000瓶/株 25 燕苗 5001瓶/株~20000瓶/株 50 >20000瓶/株 75 ≤1 hm² 15 1. 1 hm²~2. 0 hm² 25 田间种植苗 2. 1 hm²~4. 0 hm² 50 >4. 0 hm² 75 6检测方法 6.1环介导等温扩增(LAMP) 用于检测甘蔗样品中甘蔗宿根矮化病菌，见附录A。 6.2聚合酶链式反应(PCR) 用于检测甘蔗宿根矮化病菌，见附录B。 6. 3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 用于检测甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒、甘蔗条纹花叶病毒和甘蔗黄叶病毒，见附录C。 7检测结果判定 7.1实验有效判定 所有检测只有在阳性对照、阴性对照和空白对照的检测结果均正常时,才能对待检样品的检测结果 进行判定。 7.2样品检测结果判定 甘蔗宿根矮化病菌的检测结果根据附录A或附录B判定,如采用2种检测方法且检测结果不一致 2 NY/T 3179—2018 时,则以阳性结果为准；甘蔗花叶病毒、高梁花叶病毒、甘蔗条纹花叶病毒和甘蔗黄叶病毒的检测结果根 据附录C判定。在阳性对照、阴性对照和空白对照检查结果均正常的情况下，试样的检测结果呈阳性， 即判定该样品携带相应的病原；如试样的检测结果呈阴性，则判定该样品不携带相应的病原。 7.3重复检验 如果2个平行样检测结果不一致时,应再次进行检测,直到检测结果一致方可进行判定。 3 NY/T 3179—2018 附录A （规范性附录） 甘蔗宿根矮化病菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法 A.1 试剂 除另有规定外,所用试剂均为分析纯。 A.1.11.0mol/LTris-HCl(pH8.0)母液的配制：称取121.1gTris,溶解于800mL的ddHzO中,用 6mol/LHCl调节pH至8.0后,用ddHzO定容到1. 0L。 A.1.20.5mol/LEDTA(pH 8.0)母液的配制:称取186.1gNazEDTA·2HzO,加人800mL ddHO,充分搅拌,用2mol/LNaOH调节pH至8. 0后,用ddHzO定容到1. 0 L。 A. 1. 3 2XCTAB抽提缓冲液:含 100 mmol/ L Tris-HCl(pH 8. 0)、20 mmol/L EDTA、1. 4 mol/ L NaCl和2.0%CTAB,在121℃、0.1MPa下湿热灭菌20min~30min，使用前加人0.1%(V/V)的β-巯 基乙醇。 A.1.4氯仿/异戊醇(V/V)=24/1。 A.1.5检测引物序列： F3:5'- ACATCGGTACGACTGGGT- 3'; B3:5'- TGGCCGACCAAAAAAGGT - 3'; FIP(F1c+F2) :5'-GGCGTACTAAGTTCGAGCCGTT - GGTCAGCTCATGGGTGGA - 3'; BIP(B1c+B2) :5'-CCTCGCACATGCACGCTGTT - CTCAGCGTCTTGAAGACACA - 3'; LF:5'-CTCCGCACCAATGTCAATGT-3'; LB:5'-CTGAGGGACCGGACCTCATC- 3′ A.1.6其他试剂:dNTPMixture(各10mmol/L)、含有10XReactionBuffer(反应缓冲液)的BstDNA 聚合酶、乙二胺四乙酸二钠(NazEDTA·2HzO)、6mol/L盐酸（HCl)、2mol/L氢氧化钠（NaOH)、嵌 人型染料SYBRGreenI(1000X）、乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇、75%乙醇、液氮、过氧化氢（H2O2）。 A.2仪器设备和耗材 A.2.1高速台式冷冻离心机：相对离心力12000×g以上，温度4℃～8℃。 A.2.2常温离心机：相对离心力3000×g以上。 A.2.3小型离心机:可用于PCR反应管瞬间低速离心用的小型离心机。 μL1000μL。 A.2.5恒温水浴锅：要求具有显示温度的功能。 A.2.6其他设备：冰箱(2℃～4℃和一20℃）、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、液氮罐、核酸蛋白分析仪或紫 外分光光度计、电子天平（感量0.001g)。 A.2.7取样工具：砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子、钳子。 瓶、量筒。 4 NY/T 3179—2018 A.3样品的采集与前处理 A.3.1取样 每次取样前以及每取一个新的样品前，取样工具均需要用清水冲洗并用75%乙醇进行擦拭消毒。 取样过程中应避免样品交叉污染。取样和样品前处理过程中均应戴一次性手套，样品采集后，置于一次 性保鲜袋中，编号备用。 A.3.1.1蔗茎:采集1节～2节中部蔗茎。蔗茎去皮后,采用钳子直接挤压出汁，蔗汁收集在5mL～ 10mL无菌离心管中；或用带槽钻子直接在田间甘蔗蔗茎中部取汁。 A.3.1.2组培苗：小苗样品采集全株，株高超过25cm的也可采集叶片，2叶为1份。 A.3.1.3叶片：采集甘蔗植株中部带有中脉的叶片，1片为1份。 A. 3. 2 对照材料 A.3.2.1阳性对照：用已知含甘蔗宿根矮化病原菌的样品做阳性对照。 A.3.2.2阴性对照：用已知不含甘蔗宿根矮化病原菌的样品做阴性对照。 A.3.2.3空白对照：用等体积的无菌ddHzO替代样品做空白对照。 A.3.3样品的存放与运送 样品采集后，应放置在4℃左右的冰箱中，建议在1d～4d内进行后续操作。若需长途运送，应采用 保温箱中加干冰密封后运送。 A. 4总 DNA提取 A.4.1取数支2.0mL无菌离心管，并进行编号。 A.4.2称取0.2g甘蔗组培苗和叶片样品，加人液氮研磨成粉末状（研磨过程要保持液氮不挥发干 净），用小药勺将组织粉末转移到2.0mL无菌离心管中，待液氮挥发完，备用；取2.0mL蔗汁样品于2