ICS 65.080 G 20 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3175—2017 水溶肥料 壳聚糖含量的测定 Water-soluble fertilizers-Determination of chitosan content 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3175—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、中国农学会、中国植物营养与肥料 学会、土壤肥料产业联盟、北京雷力海洋生物新产业股份有限公司、青岛海大生物集团有限公司、青岛明 月蓝海生物科技有限公司、领先生物农业股份有限公司 本标准主要起草人：刘蜜、刘红芳、侯晓娜、韩岩松、黄均明、孙又宁、林茵。 I NY/T 3175—2017 水溶肥料壳聚糖含量的测定 1范围 本标准规定了水溶肥料壳聚糖含量测定的高效液相色谱法和对二甲氨基苯甲醛分光光度法试验 方法。 本标准适用于以虾蟹壳等为原料经脱钙、脱蛋白、脱乙酰后降解加工而成的液体或固体水溶肥料。 其中，高效液相色谱法不适用于含硝酸根干扰成分的水溶肥料;对二甲氨基苯甲醛分光光度法不适用于 含硝酸根、铵根等干扰成分的水溶肥料 SHIN 考方法 2规范性引用文件 下列文件对于 本文 牛的应用是 又注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 智 版本(包括所有的修改 HG/T 3696 无机化工 关分析用标准溶液、制剂及制品自 NY/T 887 密度的测定 3 高效液相色谱法 A 3.1原理 壳聚糖 -甲基- (PMP)进行衍生。 萃取除去过 3.2试剂和材米 科 所用试剂 K和深 注明规格和酉 规定执行。 3.2.1乙腈： ENTER 3.2.2甲醇 R 3.2.3三氯甲 U 3.2.4浓盐酸 3.2.5盐酸溶液:1 3.2.6 盐酸溶液:c(HC 0.3mo 3. 2.7 氢氧化钠溶液：c(NaOH )=10 mo 3.2.8盒 氢氧化钠溶液:c(NaOH) nol/L。 3.2.9 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液:c(PMP)=0.5 mol/ L。称取 8.71 g PMP,用甲 醇(3.2.2)溶解后,转移至100mL容量瓶中用甲醇定容。 3.2.10磷酸二氢钾溶液:c(KHzPO4)=0.1mol/L。采用一级水配制,调节pH至6.7,过0.45μm水 系微孔滤膜后备用，现用现配。 3.2.11氨基葡萄糖盐酸盐标准品。 0.100g，置于100mL烧杯用水溶解后，转移至100mL容量瓶中用水定容。 3.3仪器 1 NY/T 3175—2017 3.3.1通常实验室仪器。 3.3.2高效液相色谱仪：配紫外检测器。 3.3.3水解管及封管装置：体积为15mL～20mL的硬质玻璃管及喷灯、真空泵或充氮气装置，或其他 相同功能的水解管及装置。 3.3.4恒温干燥箱。 3.3.5恒温水浴锅。 3.3.6微孔滤膜：0.45μm，水系和有机系。 3.4分析步骤 3.4.1试样的制备 固体样品缩分至约100g，将其迅速研磨至全部通过0.50mm孔径试验筛（如样品潮湿，可通过 1.00mm孔径试验筛），混合均匀，置于洁净、干燥容器中；液体样品经摇动均匀后，迅速取出约100mL， 置于洁净、干燥容器中。 3.4.2试样溶液的制备 称取混合均匀的0.5g～1g固体试样或5g～10g液体试样（精确至0.0001g，以含壳聚糖 200mg～400mg为佳），置于100mL容量瓶中，先加人1.0mL浓盐酸（3.2.4)，然后加人水溶解后定 容。移取1.00mL溶液至水解管中,加人1.0mL浓盐酸（3.2.4)和8.0mL盐酸溶液（3.2.5）,封管后 于100℃水解24h。水解完成后,转移至烧杯中，加人氢氧化钠溶液（3.2.7)6mL后用盐酸溶液（3.2.6) 和氢氧化钠溶液(3.2.8)调节pH至7.0,然后转移至100mL容量瓶中，用水定容。 3.4.3衍生化 吸取0.50mL上述试样溶液于具塞试管中，加人0.50mL氢氧化钠溶液（3.2.8）和0.50mLPMP 甲醇溶液(3.2.9)，盖塞混匀后,置于70℃恒温水浴中反应70min。取出后冷却至室温，加人0.50mL 盐酸溶液(3.2.6)中和。用4mL三氯甲烷(3.2.3)萃取,弃去有机相(下层）。重复萃取3次,将得到的 上层溶液过0.45μm有机系微孔滤膜后待测。 3.4.4仪器参考条件 色谱柱：SunFireC18,5μm，（4.6X150)mm,或相当者。 流动相：乙腈（3.2.1)十磷酸二氢钾溶液（3.2.10)=18十82。 流速:1.0 mL/min。 柱温：25℃。 进样量：20μL。 检测波长：250nm。 3.4.5标准曲线的绘制 分别吸取氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液（3.2.12)0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、 4.00mL和5.00mL于7个100mL容量瓶中,用水定容。该标准系列溶液氨基葡萄糖盐酸盐的质量浓 度分别为 0 mg/ L、5. 0 mg/ L、10. 0mg/ L、20. 0mg/ L、30. 0 mg/L、40. 0mg/ L和50. 0mg/L。分别吸 取上述标准溶液各0.50mL于7个具塞试管中，按照3.4.3进行衍生化反应，按浓度由低到高进样 检测,以标准系列溶液氨基葡萄糖盐酸盐的质量浓度（mg/L)为横坐标、相应的峰面积为纵坐标,绘 制标准曲线。 3.4.6测定 将待测液在与测定标准系列溶液相同的条件下测定，在标准曲线上查出相应试样溶液中氨基葡萄 糖盐酸盐的质量浓度（mg/L)。 3.5分析结果的表述 壳聚糖含量以质量分数计，数值以百分率表示,按式(1)计算。 2 NY/T 3175—2017 X 0. 8309 X 100% ... mX103 (1) 式中： 由标准曲线查出的试样溶液中氨基葡萄糖盐酸盐的质量浓度,单位为毫克每升(mg/L); Vi 称样后的定容体积,单位为毫升(mL); D 稀释倍数； 10-3 将毫升换算成升的系数,以升每毫升(L/mL)表示； m 试料的质量,单位为克(g)； 103 将克换算成毫克的系数，以毫克每克(mg/g)表示； 0.8309- 一将氨基葡萄糖盐酸盐质量换算为氨基葡萄糖质量的系数。 取2次平行测定结果的算术平均值为测定结果，结果保留到小数点后1位。 4对二甲氨基苯甲醛分光光度法 4.1原理 壳聚糖经盐酸水解生成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖在碱性条件下与乙酰丙酮缩合形成生色原2-甲 基-3-二乙酰吡咯衍生物。生色原与对二甲氨基苯甲醛在酸性条件下反应生成紫红色化合物,在波长 525nm处测定其吸光度。在一定浓度范围内，该化合物的吸光度与氨基葡萄糖浓度呈正比例关系，由 此可以用分光光度法测定。 4.2试剂和材料 所用试剂、水和溶液的配制,在未注明规格和配制方法时,均应按HG/T 3696 的规定执行。 4.2.1浓盐酸。 4.2.2盐酸溶液：1十1。 4. 2.3 氢氧化钠溶液:p(NaOH)=400 g/ L。 4.2.4氢氧化钠溶液:p(NaOH)=40 g/L。 4.2.5碳酸钠溶液：c(Na2CO3）=0.5mol/L。称取碳酸钠53g，置于500mL烧杯用水溶解后，转移至 1000mL容量瓶中用水定容。 4.2.6乙酰丙酮溶液：移取乙酰丙酮2.0mL，用碳酸钠溶液（4.2.5）定容至50mL，于冰箱中放置 过夜。 4.2.7无醛乙醇：95%以上。 4.2.8对二甲氨基苯甲醛溶液：称取对二甲氨基苯甲醛0.8g，溶于无醛乙醇（4.2.7)15mL及浓盐酸 (4.2.1)15mL中,混匀。现用现配。 4.2.9氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液:p(氨基葡萄糖盐酸盐)=1.00g/L。称取氨基葡萄糖盐酸盐0.100 g,置于100mL烧杯用水溶解后,转移至100mL容量瓶中用水定容。 4. 2.10 氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液:p(氨基葡萄糖盐酸盐)=20.0 μg/mL。移取氨基葡萄糖盐酸盐 标准溶液（4.2.9)2.00mL至100mL容量瓶中，用水定容。现用现配。 4.3仪器 4.3.1通常实验室仪器。 4.3.2分光光度计，配1cm比色皿。 相同功能的水解管及装置。 4.3.4恒温干燥箱。 3 NY/T 3175—2017 4.3.5恒温水浴锅。 4.4分析步骤 4.4.1试样的制备 固体样品缩分至约100g，将其迅速研磨至全部通过0.50mm孔径试验筛（如样品潮湿，可通过 1.00mm孔径试验筛），混合均匀，置于洁净、干燥容器中；液体样品经摇动均匀后，迅速取出约100mL， 置于洁净、干燥容器中。 4.4.2试样溶液的制备 称取混合均匀的0.5g～1g固体试样或5g～10g液体试样（精确至0.0001g，以含壳聚糖 200mg~400mg为佳),置于100mL容量瓶中 1.0mL浓盐酸（4.2.1),然后加入水溶解后定 容。移取1.00mL溶液至水解管中,加入1.0mL浓盐酸(4.2.1)和8.0mL盐酸溶液（4.2.2),封管后 于100℃水解24h。水解完成后,转移至烧杯中，加人 氢氧化钠溶液（4.2.3)6mL，后用盐酸溶液 (4.2.2)和氢氧化钠溶液（ pH至Dd然后转移至 100 mL容量瓶中,用水定容。 4.4.3标准曲线的绘制 RD 分别移取氨基 2. 00 mL、3. 00 mL、 示准系列溶液含氨基葡萄糖盐酸盐分 4. 00 mL.5. 00 ml 置于 用