ICS 07.080 B 47 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3166—2017 家蚕质型多角体病毒检测 实时荧光定量PCR法 Detection of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus-Real time PCR method 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3166—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国桑蚕业标准化技术委员会归口（SAC/TC437）。 本标准起草单位：江苏科技大学、中国农业科学院蚕业研究所、农业部蚕桑产业产品质量监督检验 测试中心(镇江)、苏州大学、西南大学、华南农业大学。 本标准主要起草人：吴萍、郭锡杰、陈涛、贡成良、潘敏慧、李龙、孙京臣。 NY/T 3166—2017 家蚕质型多角体病毒检测 实时荧光定量PCR法 1 范围 本标准规定了家蚕质型多角体病毒(Bombya mori cytoplasmic polyhedrosis virus）的实时荧光定 量 PCR检测方法。 本标准适用于家蚕中肠组织中家蚕质型多角体病毒的检沙 2 规范性引用文件 PUBL 下列文件对于本文 件。凡是不注日期的 文件 GB/T 6682 3缩略语 下列缩略语适 BmCPV :家蚕质型多角体病毒(Bombyamorz cytop olyhedro bp:碱基对( base pair Ct值：每个） 反应管内的荧光信号达 的循环数 cDNA: mRAA 互补的 DNA分子(complementary ibonucleic DEPC: 焦碳 炭酸乙酯（di onate) dNTPs: 氧核苷三磷酸混 side triphos 日四种脱氧核糖核 苷酸dATP、dT TP、dGTP和 CEN PCR：聚合酶链式反应（polymerase chai reaction 4原理 根据BmCPV 多角体蛋白基因的保守序列设计特异性PCR引物进行 反应。利用荧光信 号伴随目的PCR产物的增加而增强的原理，根据Ct 值判断样 感染家蚕 贡型多角体病毒。 顶 5 试剂与设备 5.1 试剂与耗材 除另有规定外,所用生化试剂均为分析纯,实验用水应符合 GB/T 6682一级水要求并经灭菌或采 用超纯水。提取 RNA所用试剂应使用无 RNA 酶的灭菌双蒸水或超纯水配制,分装的容器应无 RNA 酶污染。 5.1.1 RNA提取试剂。 5. 1. 2 三氯甲烷。 5.1.3异丙醇。 5.1.475%乙醇。 5. 1.5 DEPC。 5. 1. 6 cDNA合成试剂盒。 5. 1. 7 荧光定量 PCR试剂盒。 1 NY/T 3166—2017 5.1.8无 RNA酶污染的枪头和离心管。 5.2主要仪器设备 5.2.1实时荧光定量PCR仪。 5.2.2紫外分光光度计。 5.2.3高速冷冻离心机。 5.2.4一20℃冰箱和一80℃冰箱。 5.2.5组织研磨器或研钵。 5.2.6微量加样器。 6样品的采集 采集家蚕中肠组织（0.1g～0.5g）后迅速放入液氮中，再转移至一80℃冰箱保存。 7操作方法 7.1RNA的提取 7.1.1将样品放入预冷的研钵中加人液氮,用研杵将待检样品磨成粉末状（保持液氮不挥发干净），分 装到无RNA酶的1.5mL离心管中,每0.1g组织加1.0mLRNA提取试剂,样品体积应小于Trizol体 积的10%，振荡混匀，室温（20℃～30℃)温育10min，12000g，4℃离心10min。 7.1.2将上清液转移到新的1.5mL离心管中,每1mL上清液中加人0.2mL三氯甲烷(1/5体积），剧 烈摇动15s，室温放置5min，12000g，4℃离心15min；混合物分层，RNA位于上层水相。 7.1.3将上清液小心转移到新的1.5mL离心管中，加人等体积预冷的异丙醇（可在一20℃冰箱放置 20min以上），颠倒混匀10次，室温静置10min，12000g，4℃离心10min，弃上清液，保留RNA沉淀。 7.1.4加人75%乙醇(DEPC水配制),1.0mLRNA提取试剂加人1.0mL75%乙醇,轻轻混匀， 7500g，4℃离心5min，弃上清液。 7.1.5将RNA沉淀置于室温下自然风干5min～10min,用30μL～40μL的无RNA酶超纯水常温溶 解 RNA。 7.1.6利用紫外分光光度计测定RNA溶液的光密度值。当A260/A280值为1.90～2.05时，提取的 RNA质量符合PCR的检测要求。剩余RNA置于一80℃冰箱保存备用。 7.2cDNA的合成 以7.1中提取的RNA为模板，按照市售商品化试剂盒说明书反转录合成cDNA。以Takara公司 生产的，货号为DRR047A试剂盒1)为例：首先进行去除基因组DNA反应，反应体系10μL(反应液A)， 其中,5XgDNA Eraser Buffer 2μL,gDNA Eraser 1 μL,RNA 500 ng,补加无 RNA酶超纯水至 10 μL 终体积。42℃反应2min。然后进行反转录反应，反应体系20μL，其中，5XPrimer ScriptTMBuffer 4 μL、Primer ScriptTM RT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、反应液 A 10 μL,补加无 RNA 酶超 纯水至20μL终体积。反应条件：37℃15min，85℃5s。反转录合成的cDNA置于一20℃冰箱备用。 7.3实时荧光定量PCR检测 7.3.1引物序列 正向引物:5'-ATACAAGGTTGGCATTTCAGA-3'; 反向引物:5'-ACCGCCGTTAGGATAGTAGAT-3'。 荧光定量PCR产物信息参见附录A。 1）该试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。 2 NY/T 3166—2017 7.3.2对照设置 阳性对照:含有经7.3.1引物扩增的BmCPV多角体蛋白基因片断的重组质粒DNA,质粒拷贝数 不低于1.0X103。阳性质粒制备方法参见附录B。 阴性对照:按7.1、7.2制备的健康家蚕中肠组织的 cDNA。 空白对照：超纯水。 7. 3. 3PCR 反应体系 反应体系 20μL:2XSYBR Premix Ex TaqTM 10 μL,10μmol/L正、反向引物各 0.4μL,cDNA模板 1μL，超纯水8.2μL。反应程序：95℃预变性3min，95℃15s，60℃1min，共40个循环。每个样品应重 复3次。可按照其他市售商品化试剂盒说明书进行荧光定量PCR反应。 7.3. 4PCR 反应质量控制 扩增反应结束后，阳性对照出现典型的扩增曲线，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直或低于阳性 对照荧光值的15%，表明反应体系工作正常。否则，表明PCR反应体系不正常，需重新检测， 8 结果判定 在 PCR反应体系正常工作的前提下,根据收集的荧光曲线和 Ct值判定结果。阈值设定原则根据 仪器噪声情况进行调整。判定规则如下： a) 待测样品检测Ct值小于或等于30,判定该样品检出家蚕质型多角体病毒。 b）待测样品检测Ct值大于或等于35,判定该样品未检出家蚕质型多角体病毒。 待测样品检测Ct值大于30且小于35,应重新做PCR扩增，如重复实验结果出现典型的扩增 曲线,Ct值仍然大于30且小于35,判定该样品疑是感染家蚕质型多角体病毒。 NY/T 3166—2017 附录A (资料性附录) 荧光定量PCR产物相关信息 A. 1 检测基因 BmCPV多角体蛋白基因,GenBank登录号：AB003361 A. 2 扩增产物大小及序列 扩增产物共 118 1 ATAC AGG CA GAATATCGCA AGGGACAACA 61 CA CGA ATCCTAACGGCGGT 注：画线 人 NY/T 3166—2017 附录B （资料性附录） 阳性质粒的制备 B.1 以感染 BmCPV 的家蚕中肠组织的 RNA为模板,反转录合成 cDNA。操作方法同 7.2。 B.2以反转录合成的cDNA为模板,用正向引物和反向引物扩增目的基因片段,PCR反应体系25μL： 10XPCR缓冲液2.5μL,dNTPs(各10mM)0.5μL，正、反向引物(10μmol/L)各0.6μL，cDNA模板 1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.5μL,灭菌水19.3μL。反应条件为:94℃2min;94℃30s,58℃40s,72℃ 40s,30个循环；72℃延伸10min。反应结束后，取5μLPCR产物在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳 分析。 B.3PCR产物经电泳鉴定后,按试剂盒说明书进行胶回收纯化目的片段,将目的片段与克隆载体连 接，将其转化感受态细胞，提取重组质粒并进行测序验证。 B.4阳性质粒用碱裂解法进行提纯，根据紫外分光光度计测定OD26o的值计算质粒浓度，按式(B.1)计 算质粒拷贝数。 = NA× (B. 1) w 式中： 质粒拷贝数，单位为每毫升质粒拷贝数(个/mL)； -阿伏伽德罗常数，通常表示为6.02×1023,单位为每摩尔物质的微粒个数（个/mol)（copies/ mol) ; 质粒浓度,单位为克每毫升(g/mL); 质粒平均分子量，单位为克每摩尔（g/mol）。 5