ICS 67 B 22 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3164-2017 黑米花色的测定 高效液相色谱法 Determination of anthocyanins in black rice-High-performance liquid chromatography 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3164—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：中国水稻研究所、农业部稻米及制品质量监督检验测试中心 本标准主要起草人：邵雅芳、扈战强、段彬伍、于永红、方长云、胡贤巧、卢林、朱智伟。 I NY/T 3164—2017 黑米花色的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了黑米中的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-0-葡萄糖苷2种花色苷的高效液 相色谱检测方法。 本标准适用于黑米中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷的测定。 矢车菊素-3-0-葡萄糖苷和芍药素-3-0-葡萄糖苷 2种花色苷的检出限均为 0.10 mg/kg,定量 限均为0.40mg/kg。 2规范性引用文件 RD 下列文件对本 件的弓 是注日期的 注日期的版本适用于本文件。 用文件,其最新 文。 凡是不注日期的引 GB 5009.3 食品安全国家标准 食品中水分的测定 RESE GB/T 668 子析 用水规格 和试验 S 3原理 黑米经盐酸 甲醇溶液振荡提取 后，其花色苷提取液用高效液相色谱法测 定，外标 示法定量。 RC 4试剂和材料 R 除非另有 中仅使用分析纯的试剂和符合 级水 4.1浓盐酸(H 1):质 CEI 4.2甲醇(OH HD色 4.3甲酸(CH2 4.4盐酸溶液 的 盐酸(4.1)16.67 mL,边加边摇,待 4.5提取液：甲醇 1酸溶液（4. 和150mL的盐酸 溶液(4.4)混匀。 4.6 流动相 A:0.5%的甲酸水溶液,取 5 mL甲酸(4.3)) ,用去离子水定容至 1000mL,使用前过0.45 μm的水相滤膜,并脱气。 4.7流动相B:0.5%的甲酸甲醇溶液,取 5mL甲酸(4.3),用甲醇(4.2)定容至1000mL,使用前过 0.45μm的有机相滤膜，并脱气。 4.8矢车菊素-3-0-葡萄糖苷标准品（cyanidin-3-0-glucoside),CAS号:7084-24-4,纯度≥95%。 4.9芍药素-3-O-葡萄糖苷标准品（peonidin-3-O-glucoside),CAS号：6906-39-4,纯度≥95%。 4.10矢车菊素-3-0-葡萄糖苷单标储备溶液：准确称取10.0mg的矢车菊素-3-0-葡萄糖苷（精确 至0.00001g),用提取液（4.5)定容至100mL,即得到100mg/L的矢车菊素-3-0-葡萄糖苷单标储备 液。分装于若干棕色试管中，密闭保存于一18℃或以下，保存有效期为6个月。使用前,取出试管，平衡 至室温后一次用完,不能反复使用。 4.11芍药素-3-0-葡萄糖苷单标储备溶液：准确称取10.0mg的芍药素-3-0-葡萄糖苷（精确至 0.00001g),用提取液(4.5)定容至100mL,即得到100mg/L的芍药素-3-0-葡萄糖苷单标储备液。 1 NY/T 3164—2017 分装于若干棕色试管中，密闭保存于一18℃或以下，保存有效期为6个月。使用前,取出试管，平衡至室 温后一次用完,不能反复使用。 4.12分别准确移取0.02mL、0.05mL、0.20mL、0.50mL、2.00mL、5.00mL的车菊素-3-0-葡 萄糖苷单标储备溶液（4.10)于6个10mL的容量瓶中，再分别依次加人0.005mL、0.01mL、0.05mL、 0.10mL、0.50mL、1.00mL的芍药素-3-0-葡萄糖苷单标储备溶液（4.11),用提取液（4.5)作为溶 剂,分别定容至10mL,得到浓度为0.20mg/L、0.50mg/L、2.00mg/L、5.00mg/L、20.00mg/L、 50.00mg/L的矢车菊素-3-0-葡萄糖苷和浓度为0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、 5.00mg/L、10.00mg/L的芍药素-3-0-葡萄糖苷的混合标准工作液。 5仪器设备 5.1高效液相色谱仪：带紫外/可见光或二级管阵列检测器。 5.2 分析天平:感量为 0.000 1g和 0.000 01 g。 5.3磨粉机。 5. 4 离心机:转速≥5 000 r/min。 5.5摇床。 5.6 15mL离心管。 5.750mL具塞离心管。 5.8 滤膜:0.45μm,有机相滤膜和水相滤膜。 6分析步骤 6.1试样制备 取有代表性的黑米稻谷样品500g，脱壳后，去除稻壳、稻谷和其他杂质，混匀后，采用四分法分取样 品20.0g左右，并置于磨粉机上磨成粉末，过0.25mm孔径大小的筛子后，冰箱低温冷藏待测。 6.2花色苷提取 15mL离心管（5.6）中，向其加人10.00mL花色苷提取液（4.5），混后摇床震荡30min，然后3000 r/min离心10min，并将上清液倒人50mL具盖离心管（5.7)中。再向离心管中加人10.00mL提取液 （4.5)进行二次提取，混匀震荡30min，3000r/min离心10min，将第二次提取的上清液倒人同一50mL 具盖离心管中。合并2次提取液，混匀后过0.45μm的有机相滤膜，待测。 6.3测定 6.3.1 色谱参考条件 色谱参考条件如下： a）色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm,5.0μm，或者性能相当者； (4. 7); 检测波长：520nm； d) 柱温：30℃； 进样量：10μL； f) 梯度洗脱条件和流速见表1。 2 NY/T 3164—2017 表1梯度洗脱表 时间，min 流速,mL/min 流动相A,% 流动相B,% 曲线 0 1. 0 90. 0 10. 0 线性 2. 0 1. 0 90.0 10. 0 线性 6. 0 1. 0 80.0 20.0 线性 10. 0 1. 0 70. 0 30. 0 线性 15. 0 1. 0 65. 0 35.0 线性 20. 0 1. 0 50. 0 50.0 线性 24.0 1. 0 10. 0 90.0 线性 29. 0 1. 0 90.0 10. 0 线性 30.0 1. 0 90.0 10. 0 线性 6.3.2色谱分析 分别取10μL混合标准工作液（4.12)或黑米花色苷提取溶液，按照6.3.1所列色谱参考条件上机 测定，以标准工作液浓度为横坐标，以相应色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。根据黑米花色苷提 取液中花色苷的峰面积用标准曲线计算出来提取液中花色苷的浓度。提取液中花色苷浓度应在标准曲 线的线性范围内，超出范围时应稀释。色谱图参见附录A。 6.3.3水分测定 按照GB5009.3的规定执行。 结果计算 黑米中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷或芍药素-3-O-葡萄糖苷的含量按式(1)计算。 cXVX100 (1) mX(100-W) 式中: 样品中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷或芍药素-3-O-葡萄糖苷的含量,单位为毫克每千克 (mg/ kg) ; 待测液中各花色苷的质量浓度,单位为毫克每升(mg/L); V—一样品提取液总体积,单位为毫升(mL); m- 试样的质量，单位为克(g)； W- 试样水分含量，单位为百分率（%）。 测定结果取2次测定的算数平均值，计算结果保留至小数点后2位。 8精密度 在重复性和再现性条件下，获得的2次独立测试结果的绝对差值不大于这2个测定值算术平均值 的10%。 3 NY/T 3164—2017 附录A (资料性附录) 标准溶液色谱图 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(50. 00mg/L)和芍药素-3-O-葡萄糖苷(10. 00mg/L)的 HPLC色谱见 图 A.1。 紫外吸收强度，AU 0.090 0.080 0.070 0.060 28 30 t,min 说明 2 标准 520 NY/T 3164—2017 中华人民共和国 农业行业标准 黑米花色苷的测定高效液相色谱法 NY/T3164—2017 * * * 中国农业出版社出版 (北京市朝阳区麦子店街18号楼) （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行 各地新华书店经销 * * * 开本880mmX1230mm1/16 印张0.75 字数15千字 2018年5月第1版 2018年5月北京第1次印刷 书号：16109·4356 定价：18.00元 版权专有侵权必究 NY/T 3164—2017 举报电话：（010）65005894