ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3152.6—2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第6部分：藻类生长影响试验 Risk assessment test guidelines for microbial pesticide- Part 6 : Algae growth effect test 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3152. 6—2017 前言 NY/T3152《微生物农药 环境风险评价试验准则》分为6个部分： 第1部分：鸟类毒性试验； 第2部分：蜜蜂毒性试验； -第3部分：家蚕毒性试验； ——第4部分：鱼类毒性试验； 一第5部分：类毒性试验； 一第6部分：藻类生长影响试验。 本部分为NY/T3152的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部种植业司提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：周欣欣、卜元卿、周军英、曲、姜锦林、杨鸿波、续卫利。 NY/T 3152.6—2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第6部分：藻类生长影响试验 1 范围 本部分规定了微生物农药对藻类生长影响试验的材料、条件、试验操作、质量控制、试验报告等的基 本要求。 2规范性引用文件 下列文件对 本文 注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日 期的 引用文件 ,其最新版本(包括所有的修改息 适用 GB/T 31270. 化 衣药环境安 评价试 14部分 制试验 SEARCI S 3术语和定 下列术语和定义适月 用于本文件 3. 1 R 微生物农药 是以细菌 菌、病 毒和原生动物或基因修饰 分 具有防 治病、虫、草、鼠等 有害生物作用的 生物农 3. 2 供试物 es 试验中需要测 式的物 Y 3. 3 菌落形成单位 colony forming unit, CFU 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集 3. 4 细菌芽孢、真菌孢子、细菌或原生动物孢囊的单位unit of bacterial or fungal spore and bacterial or protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽孢、孢子或孢囊,通常是指能在合适的培养基上形成单个CFU的一个 完整的实体， 3. 5 细菌营养体的单位unit of vegetative bacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3. 6 原生动物 protozoa 原生动物门各个成员的一个完整的营养体、孢子或孢囊。 3.7 病毒virus 1 NY/T 3152.6—2017 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。 3. 8 最大危害暴露量maximumhazard exposurelevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全 系数的乘积来表示。 3. 9 半效应浓度median effective concentration,ECso 生长影响试验中，在规定时间内，使受试藻类生长量或生长率较空白对照组的差异为50%时的供 试物浓度,用ECso表示。本部分中,以藻类生长量变化百分率计算而得到的半效应浓度用EyCso表示； 以藻类生长率变化百分率计算而得到的半效应浓度用ErCso表示。 3. 10 平均生长率 average growth rate 一定暴露时间内藻类单位生物量增长的对数值，在本部分中用μ表示。 3. 11 生物量增长 yield 一段暴露时间内藻类单位生物量的增加量，即暴露结束时的单位生物量减去暴露开始时的单位生 物量，在本部分中用Y表示。 4试验概述 在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试藻类生长的影响。当供试物最大危害 暴露量处理组中较对照组藻类生长影响达到50%及以上时，则还需进行供试物对藻类剂量效应试验， 以测定EC5o值及其95%置信限。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验生物 受试藻可来自绿藻门、裸藻门、轮藻门和蓝藻门等，推荐普通小球藻（Chlorella uulgaris）、斜生栅列 藻(Scenedesmus obliquus)或羊角月芽藻(Selenastrum capricornutum)等。 5.1.2.供试物 5.1.2.1类型 微生物母药、制剂产品等。 5.1.2.2批次 告中记录供试物的批次。 5.1.2.3计数方法 计数方法如下： 细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定； 真菌孢子以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定； 原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定； -病毒以包涵体等感染单位为计数单位,可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定； 其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法。 以上推荐计数方法，参见附录A、附录B、附录C。 2 NY/T 3152. 6—2017 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 灭菌锅。 显微镜。 解剖镜。 分光光度计。 聚合酶链式反应仪。 水质测定仪。 温湿度计。 玻璃器血。 天平等。 5.1.4培养基 行繁殖培养 中斜生栅漠 号培养基，羊角月牙藻宜用 BG11 培养基,普通小球藻宜用 S 后养基 5.1.5 试验条件 藻类适宜 的试马 检环境温度21℃ ℃（单次试验温度控制在王2℃ 习光照，光照强度差异 应保持在士1 L强44401×188801x。 试验条件在满足藻类生 应充分考虑供试物 的生长和活性要 ARCH RA 5.2试验操作 5.2.1暴露途径 藻-水混合 妾触暴露途 5.2.2处理组 和对照组 试验设置供 试物处理组、 微生物的传染性， 各处理组及对 干昭 5.2.3效应观察 V 试验期间每日又 数板准 十数藻类细胞数， 同一样品至少计 据进行 数理统 长差异。 5.2.4试验周期 A 试验观察时间持续 96 h。 5.2.5最大危害暴露量试验 藻-水混合接触暴露途径,供试物最大危害暴露量 单位/m 成按照供试微生物农药推荐施 用量在15 cm水体中浓度的1 000 倍。 两者均能达到时，以较高浓度作为最大危害暴露量。当因制剂剂 型、水质等原因，不能达到最大危害暴露量时，可采用供试物在水中能达到的最大量进行试验。试验开 始后，每日记录藻类生长情况。当受试藻在试验期间未出现生长受影响情况，则无需进行剂量效应试 验；当受试藻在试验期间生长影响达到50%及以上时，则需进行剂量效应试验。 5.2.6剂量效应试验 根据最大危害暴露量试验结果，按一定比例间距设置5组～7组供试物系列浓度，试验观察期为96 h，每隔24h取样，在显微镜下用血球计数板准确计数藻细胞数，计算各处理浓度下藻类生长变化率，并 据此计算半效应浓度ECso值及其95%置信限。 5.3数据处理 5.3.1统计方法选择 试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3、5.3.4、5.3.5中所述的统计学方法，也可根据试验情况 3 NY/T 3152. 6—2017 选择其他合适的统计方法。 5. 3. 2 差异显著性检验 5.3.2.1概述 差异显著性检验推荐采用独立样本 t检验或单因子方差分析(One-Way ANOVA,LSD检验)等。 显著水平取p<0.05(差异显著)、p<0.01(差异极显著）。 5.3.2.2独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。 Xi -X2 (1) +o2, V n-1 式中： X1,X2 分别为两样本平均数； 分别为两样本方差； n 样本容量。 5.3.2.3 One-Way ANOVA方差分析(LSD检验) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。LSD检验按式(2)计算。 LSD. = ta(df,)Ss,-, (2) 式中： ta(df.) 在F检验中误差自由度下,显著水平为α的临界t值； S2,一; 均数差异标准误,按式(3)计算。 Ss,-±, = V2MS./n (3) 式中： MS. F检验中误差均方； n 各处理重复数。 5.3.3生物量增长的影响百分率 处理组藻类生物量的影响百分率按式(4)计算。 X 100 (4) Y. 式中： 处理组生物量变化百分率,单位为百分率（%)； Y 空白对照组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL）； Y,- 处理组测定的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)。 5.3.4生长率的影响百分率 处理组藻类生长率的影响百分率按式(5)计算。 (5) μc 式中： 处理组藻类生长率变化百分率,单位为百分率（%)； 空白对照组生长率的平均值； 处理组生长率的平均值。 t 其中,μ按式(6)计算。 InX, -InX; j-i= X 100 (6) t; -ti NY/T 3152. 6—2017 式中： μj-i 在时间点i到时间点i之间的平均生长率，单位为百分率（%)； X, - -在时间点i时的藻类单位生物量,用细胞数表示时单位为个每毫升(个/mL)； X: - 在时间点i时的藻类单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）； ti,tj 试验开始i点和观察i点的时间，单位为小时(h)，t；一般为0。 5.3.5半数效应浓度 按藻类生物量变化百分率和藻类生长率变化百分率分别计算半数效应浓度EyCso和Er