ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3152.5—2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第5部分：泽类毒性试验 Risk assessment test guidelines for microbial pesticide- Part 5:Daphnia toxicity test 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3152.5—2017 前言 NY/T3152《微生物农药环境风险评价试验准则》分为6个部分： 第1部分：鸟类毒性试验； 第2部分：蜜蜂毒性试验； 第3部分：家蚕毒性试验； 第4部分：鱼类毒性试验； —第5部分：蚤类毒性试验； —第6部分：藻类生长影响试验。 本部分为NY/T3152的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本部分由农业部种植业司提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：谭丽超、周艳明、卜元卿、续卫利、姜辉、陈朗、田丰。 I NY/T 3152.5—2017 微生物农药环境风险评价试验准则 第5部分：类毒性试验 1 范围 本部分规定了微生物农药对蚤类毒性试验的材料、条件、访 试验操作、质量控制、试验报告等的基本 要求。 2规范性引用文件 ARD 下列文件对于 本文件的应用是 不可 注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日其 期的引用文件 其最新 版本(包括所有的修改） 适用于 GB/T3127 药环境安 式验# N3部分 活动抑制试验 S 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 JRA 3. 1 微生物农药 stieides 是以细菌、 生动物或基因修饰的微生物等活体为有效成分 治病、 、虫、草、鼠等 有害生物作用 用的 CENTER 3. 2 供试物 es 试验中需要 3. 3 R 菌落形成单位 由单个菌体或聚集成因的多 菌体在固体培养基上生长 3. 4 细菌芽孢、真菌孢子、细菌或原生动物孢囊 bacterial or fungal spore and bacterial or protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽孢 孢子或孢囊,通常是指能在合适的培养基上形成单个CFU的一个 完整的实体。 3.5 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3. 6 原生生物protozoa 原生生物门各个成员的一个完整的营养体、孢子或孢囊。 3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。 1 NY/T 3152.5—2017 3. 8 最大危害暴露量maximum hazard exposure level 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全 系数的乘积来表示。 3. 9 毒性 toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力。其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复 制和生命活动。 3. 10 半数抑制量 median effective dose or concentration, EDso/ECso 在规定时间内,通过指定感染途径,引起50%受试生物活动受抑制时所需最小微生物数量或毒素量。 3. 11 活动抑制immobilisation 轻晃试验容器，潘在15s内不能游动视为活动抑制，但允许附肢微弱活动。 4试验概述 在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试遥的活动受抑制情况。当供试物最大 危害暴露量出现对受试生物50%及以上具有活动抑制时，则还需进行剂量效应试验和活动抑制验证试 验。活动抑制以ED5o/ECso表征。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1供试生物 推荐使用大型遥(Daphnia magna Straus),保持良好的培养条件,使大型蚤的繁殖处于孤雌生殖状 态。选用实验室条件下培养3代以上、出生24 h内的非头胎泽。受试泽应来源于同一母系的健康泽， 未表现任何受胁迫现象（如死亡率高、出现雄蚤和冬卵、头胎延迟、体色异常等）。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 微生物母药、制剂产品等。 5.1.2.2批次 通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报 告中记录供试物的批次。 5.1.2.3计数方法 计数方法如下： 细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定： -真菌孢子以CFU为计数单位,可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定； 一原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定； 一病毒以包涵体等感染单位为计数单位,可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定; 一其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法。 以上推荐计数方法，参见附录A、附录B、附录C。 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 2 NY/T 3152. 5—2017 灭菌锅。 显微镜。 解剖镜。 分光光度计。 聚合酶链式反应仪。 水质测定仪。 温湿度计。 玻璃器皿。 天平等。 5.1.4试验条件 类的培养、驯化及试验推荐使用重组水著选择其他水应参见附录 D 的规定。重组水推荐使用 ISO标准稀释水、Elend M4 培养液和 lendt M7 培养液,配置方法参见附录 试验期间水质应保持 稳定，满足pH在6. ，溶解氰大手 CO 计)在140 mg/L~ 250mg/L;对于其他泽 可适当 低水 质硬度 验中 光照周期(光暗比 为 16h：8h，光照强度 1 000 1x~1 500 定期使用充 分浓 的藻悬浮液进行喂食 类可 选择普通小球藻(Chlorella vul- garis）、斜生栅列 Scanelles mus obligi 5或羊 角月 芽澡e enastrun rnutun m)等。喂食量应 以提供每只泽 有机 碳数量为 基础,推荐范围为 0 2mg CP 足泽类生长条件 下，应充分考 虑供试物的生 长和活性要求 5.2试验操作 根据供试物 特性选 龙平静态 验法 5.2.2暴露途 接触暴露途 。 CE 5.2.3处理组和 1对照组 行，每 试验设置供 每组设 平行5只受试。 考虑微生物的 d 5.2.4效应观察 试验期间每日 活 吊症 5.2.5试验周期 试验观察时间持续至 21 d。如果在试验观察时间末期,处理组受试泽 始出现活动抑制或明显异 常，则要延长暴露时间，直至受试泽恢复或确 活动受抑制 5.2.6最大危害暴露量试验 水体接触暴露途径，供试物最大危害暴 或按照供试微生物农药推荐施用量在 15cm水体中浓度的1000倍设计最大危害暴露 两者均能达到时，以较高浓度作为最大危害暴露 量。当因制剂剂型、水质等条件限制，供试物溶液浓度不能达到最大危害暴露量时，则采用供试物在水 中能配置得到的最大量进行试验。试验开始后，每日观察并记录受试泽的活动受抑制数和异常症状。 当受试泽在试验期间未发生活动抑制，则无需进行剂量效应试验和活动抑制验证试验；当受试在试验 期间出现50%及以上的活动抑制，则需进行剂量效应试验和活动抑制验证试验。 5.2.7剂量效应试验 根据最大危害暴露量试验结果，按一定比例间距设置5组～7组供试物系列浓度，将受试泽暴露于 不同浓度的供试物下，试验开始后，每日观察并记录受试泽的活动受抑制数及异常症状，求出试验结束 时供试物对泽类的EC50值及其95%置信限。 3 NY/T 3152.5—2017 5.2.8活动抑制验证试验 将用无菌水清洗后的受试遥进行组织破碎，然后用无菌水冲洗破碎组织，取适量清洗液接种至选择 培养基,将培养物置于适宜生长条件下培养,分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等 方法鉴定并确认为目标菌株后，再以相同暴露途径感染健康的受试潘。如果受试泽出现活动抑制，则证 实目标菌株对泽类具有活动抑制能力。 5.3数据处理 5.3.1统计方法选择 试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适 的统计方法。 5.3.2差异显著性检验 5.3.2.1概述 差异显著性检验推荐采用独立样本 t检验或单因子方差分析(One-Way ANOVA,LSD检验)等。 显著水平取p<0.05(差异显著)、p<0.01(差异极显著)。 5.3.2.2独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。 +o n-1 式中： X1,X2 分别为两样本平均数； 分别为两样本方差； n 样本容量。 5. 3. 2. 3 OneWay ANOVA 方差分析(LSD 检验) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。LSD检验按式(2)计算。 LSD. = ta(df.) St,; (2) 式中： ta(df.) 在F检验中误差自由度下,显著水平为α的临界t值； S,-j 均数差异标准误,按式(3)计算。 Ss,-, = V2MS./n ·(3) 式中: MS。 F检验中误差均方； n 各处理重复数。 5.3.3半数抑制量计算 泽类半数抑制量EDso/ECso的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算，也可应用有 关毒性数据计算软件进行分析和计算。具体计算方法见GB/T31270.13。 6 试验报告 试验报告应包括下列内容： 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号； 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况； 试验