ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3152.4—2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第4部分：鱼类毒性试验 Risk assessment test guidelines for microbial pesticide- Part 4:Fish toxicity test 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3152. 4—2017 前言 NY/T3152《微生物农药环境风险评价试验准则》分为6个部分： 第1部分：鸟类毒性试验； 第2部分：蜜蜂毒性试验； 第3部分：家蚕毒性试验； 第4部分：鱼类毒性试验； 第5部分：类毒性试验； 一第6部分：藻类生长影响试验。 本部分为NY/T3152的第4部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部种植业司提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所 本部分主要起草人：曲、卜元卿、田丰、周艳明、续卫利、瞿唯刚、姜锦林。 I NY/T 3152. 4—2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第4部分：鱼类毒性试验 1 范围 本部分规定了微生物农药对鱼类毒性试验的材料、条件、试验操作 质量控制、试验报告等的基本 要求。 2规范性引用文件 下列文件对于本 的应中是 期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引 最新版本 （包括所有的修改单) 适用于之 GB/T31270 12 化拿衣 环境安圣 价试验准贝 部分：鱼类 S 3术语和定义 下列术语和定义 文件 3. 1 微生物农药 nicrobi pesticide 是以细菌、真菌 病毒 等活 防治病 物成 虫、草、鼠等 初农材 有害生物作用的 3. 2 供试物test sub 试验中需要测试自 GRI 3. 3 菌落形成单位 ndosum suruoy4 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上 生长繁殖所形成的集落 3. 4 细菌芽孢、真菌孢子、细菌或原生动物孢囊bacterial or fungal spore and bacterial or protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽孢、孢子或孢囊,通常是指能在合适的培养基上形成单个CFU的一个 完整的实体。 3.5 细菌营养体 vegetativebacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3. 6 原生生物 protozoa 原生生物门各个成员的一个完整的营养体、孢子或孢囊。 3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。 NY/T 3152. 4—2017 3.8 最大危害暴露量maximum hazard exposure level 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量,通常以预测暴露量与安全 系数的乘积来表示。 3. 9 毒性 toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力。其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复 制和生命活动。 3. 10 致病性pathogenicity 微生物感染宿主后,在宿主体内存活及繁衍,对宿主造成损伤或病变的能力,通常与宿主的耐受性 或敏感性有关。 3. 11 半数致死量 median lethal dose or concentration,LDso / LCso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或 毒素量。 3.12 半数感染量median infective dose or concentration,IDso/ICso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或 毒素量。 4试验概述 在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试鱼类的毒性和致病性等影响。当供试 物最大危害暴露量出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时,则还需进行剂量效应试验和致死 (病)验证试验。致死毒性以 LDso / LCso表征;致病性以 IDso / ICso表征。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验生物 推荐鱼种为斑马鱼（Brachydonio rerio）、鲫（Carassius auratus）、鲤（Cyprinus carpio）、虹鳟（On corhynchusmykiss）、青(Oryzias latipes)或稀有鲫（Gobiocypris rarus）等。受试鱼要求健康无病， 未性成熟的当年生幼鱼,并采用满足其生理要求的驯养和试验条件。具体体长和适宜水温见附录A。 并根据以下原则选择受试鱼： 尽可能与微生物农药靶标宿主分类地位相近； 一选择以微生物农药靶标生物为食的鱼类； 一生物学资料丰富的鱼种； 一选择幼年期的试验物种，避开产卵期。 受试鱼类应在测试环境条件下驯养7d～14d,每日光照12 h～16 h,每天定时喂食1次～2次,及时 清除粪便及食物残渣。试验前24h停止喂食。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 微生物母药、制剂产品等。 2 NY/T 3152. 4—2017 5.1.2.2 批次 通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报 告中记录供试物的批次。 5.1.2.3计数方法 计数方法如下： 细菌可采用平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定； 真菌孢子以CFU为计数单位，可采用平板菌落计数法或血球计数板法等测定； 原生动物以个体数目为计数单位,可采用血球计数板法等测定； 病毒以包涵体等感染单位为计数单位，可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定； -其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的 的计数方法 以上推荐计数方法,参见附录B、附录 泉口附景D 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 灭菌锅。 显微镜。 解剖镜。 S 分光光度计 聚合酶链式反应 仪。 URA 水质测定仪 温湿度计。 玻璃器血。 天平等。 5.1.4试验条 试验用水为 处理 4h的自 或注 水 水质硬度 在 10 mg/ L~250 to以 aC03. 1 十pH在6.0 验期间溶解 气 饱 和值的60%。 试验条件在满足鱼类 式物的生 长和活性要求 5.2试验操作 5.2.1方法的选择 根据供试物特性选择静态试验法或半静态试验法 5.2.2暴露途径 根据供试物特性选择接触暴露途径、饲喂暴露途径或腹腔注射暴露途 5.2.3处理组和对照组 试验设置供试物处理组、空白对照组和灭活对照组等。每组设置4个平行，每个平行10尾鱼。考 虑微生物的传染性，各处理组及对照组应避免交叉污染。 5.2.4效应观察 试验期间每日对受试鱼的饲料食用状况、异常行为、死亡等进行观察和记录。当鱼没有任何肉眼可 见的活动，如鳃呼吸、碰触尾鳍无反应，即可判断该鱼已死亡。 5.2.5试验周期 试验观察时间应持续30d。当在试验观察时间末期，处理组受试鱼开始出现死亡或明显病征，则需 延长试验观察时间,直至受试鱼恢复正常或确定死亡。 5.2.6最大危害量暴露量试验 以下列不同暴露途径分别设置供试物最大危害暴露量。当因制剂剂型、水质等条件限制，供试物溶 3 NY/T 3152. 4—2017 液浓度不能达到最大危害暴露量时,则采用供试物在水中能配置得到的最大量进行试验。试验开始后， 每日观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡情况。当受试鱼在试验期间未发生死亡(病变)或死亡(病变) 率不超过50%,则无需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。不同暴露途径供试物最大危害暴露量 分为: a) 接触暴露量。供试物最大危害暴露量试验浓度为106单位/mL，或按照供试微生物农药推荐 施用量在15cm水体中浓度的1000倍计算设计最大危害暴露浓度。两者均能达到时，以较高 浓度为最大危害暴露量。 b）饲喂暴露量。供试物最大危害暴露量试验浓度为供试微生物农药推荐施用量在15cm深水体 中浓度的100倍，将供试物添加到饲料中连续饲喂5d后，正常饲喂至试验结束。 c) 腹腔注射暴露量。供试物最大危害暴露量为供试微生物农药推荐施用量在15cm深水体中浓 度的10倍，注射量为每克体重0.01mL。 5.2.7剂量效应试验 根据最大危害暴露量试验结果,按一定比例间距设置5组～7组供试物系列浓度,将受试鱼暴露于 不同浓度的供试物下,试验开始后,每日观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡情况,求出试验结束时供 试物对受试鱼类的 LDso/ LCso值或IDso/ICso值及其 95%置信限。 5.2.8致死(病)验证试验 在无菌条件下将死鱼或病鱼进行表面消毒后解剖,分离感染组织并接种至适合的培养基质中，将培 养物置于适宜目标菌株生长条件下培养，分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方 法鉴定并确认为目标菌株后,再以相同暴露途径感染健康的受试鱼。如果受试鱼出现与先前试验相同 的病症,则证实目标菌株对受试鱼类具有致死(病)能力。 5.3数据处理 5.3.1统计方法选择 试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适 的统计方法。 5.3.2差异显著性检验 5.3.2.1概述 差异显著性检验推荐采用独立样本 t 检验或单因子方差分析(F 检验 One-Way ANOVA,LSD 检 验)等。显著水平取p<0.05(差异显著)、p<0.01(差异极显著)。 5. 3. 2.2独立样本 t 检验 2组均值比较时