ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3152.22017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第2部分：蜜蜂毒性试验 Risk assessment test guidelines for microbial pesticide- Part 2:Honeybee toxicity test 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 5发布 NY/T 3152.2—2017 前言 NY/T3152《微生物农药环境风险评价试验准则》分为6个部分： 第1部分：鸟类毒性试验； 第2部分：蜜蜂毒性试验； 第3部分：家蚕毒性试验； -第4部分：鱼类毒性试验； -第5部分：类毒性试验； —第6部分：藻类生长影响试验 本部分为NY/T3152的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本部分由农业部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：卜元卿、姜辉、王宏伟、周欣欣、程燕、何明远、周军英 I NY/T 3152.2—2017 微生物农药环境风险评价试验准则 第2部分：蜜蜂毒性试验 1 范围 本部分规定了微生物农药对蜜蜂毒性试验的材料、条件 、试验操作、质量控制、试验报告等的基本 要求。 本部分适用于微生物农药登记而进行的蜜蜂毒性试验 P 2规范性引用文件 下列文件对于本文 凡是 注日期的 件。凡是不注日期的引用文 文件,其最 包括所有的修改单 GB/T 31270. 学农药王 境安全 评价试验准则 第10 试验 3术语和定义 S 适用于 下列术语和定义 3. 1 A 微生物农药 micQbial pesticides 、病毒 生动物或基因修饰的微生物等活体为有效成分具 防治病 是以细菌、真菌 和 虫 、草、鼠等 有害生物作用的农 工 CENTE! 3. 2 供试物 test sub bstance 试验中需要测试的 的物质 3. 3 R 菌落形成单位 CFU 由单个菌体或聚集成团的多 个菌体在固体培养基 3. 4 细菌芽孢、真菌孢子、细菌或原生动物孢囊 bacterial or funga alsporeand bacterial or protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽孢、孢子或孢囊 通常是 合适的培 上形成单个CFU的一个 完整的实体。 3. 5 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。 3. 6 原生动物protozoa 原生动物门各个成员的一个完整的营养体、孢子或孢囊。 3.7 病毒 virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。 1 NY/T 3152. 2—2017 3. 8 最大危害暴露量maximumhazard exposurelevel 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全 系数的乘积来表示。 3. 9 毒性toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力，其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复 制和生命活动。 3. 10 致病性 pathogenicity 微生物感染宿主后,在宿主体内存活及繁衍,对宿主造成损伤或病变的能力，通常与宿主的耐受性 或敏感性有关。 3. 11 半数致死量 量median lethal dose or concentration, LDso/LCso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或 毒素量。 3. 12 半数感染量median infective dose or concentration，IDso/ICso 在规定时间内,通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或 毒素量。 4试验概述 在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试蜜蜂的致死毒性和致病性等影响。当 供试物最大危害暴露量出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时，则还需进行剂量效应试验和 致死(病)验证试验。致死毒性以 LDso表征;致病性以 IDso 表征。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验生物 推荐使用意大利工蜂（ApismelliferaL.）、中华蜜蜂（Apisceranacerana）等。选择羽化3d内的 工蜂,受试蜂应来自姊妹蜂王，健康、大小一致。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 微生物母药、制剂产品等。 5.1.2.2批次 通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报 告中记录供试物的批次。 5.1.2.3计数方法 计数方法如下： 细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定 真菌孢子以CFU为计数单位，可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定； -原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定； 2 NY/T 3152. 2—2017 病毒以包涵体等感染单位为计数单位，可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定； 其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法， 以上推荐计数方法,参见附录 A、附录 B、附录 C。 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 灭菌锅。 显微镜。 解剖镜。 分光光度计。 聚合酶链式反应仪。 温度计。 PUBLI 蜂笼。 天平等。 5.1.4试验条件 一般情况下，试验温度 足蜜蜂生长条件下， 还需充分考虑供试生 可的生 长和活忙 5.2试验操作 S 5.2.1试验方法 蜜蜂毒性试 验包 括经内 5. 2.2处理组 和对 照 试验设置供试物处理组 空白对照组和灭活 蜂 锋。考虑微 生物的传染性，各处 理组及对！ 5.2.3效应观察 试验期间每日对 受试蜜蜂 应时认为蜜 蜂已死亡。 EN 5.2.4试验周期 C 试验时间持续 当在 处理组受试蜜蛇 ER .则需延长观 察时间，直至确定对受 5.2.5最大危害暴露 以1.0×108单位/m 或供试物推荐田间施用量的100 （两者均能达到时， 取较高值作为最大危害暴露量 当因制剂剂型等条件限制，不能达到最大危 暴露量时，则以供试物 在水中能配制到的最大剂量进行试验。试验期间每日观察并记录蜜蜂的中 毒症状及死亡情况。当受试 蜜蜂在试验期间未发生死亡,则无需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验；当受试蜜蜂在试验期间出 现50%及以上的个体死亡或致病,则需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。暴露分为： a）经口暴露。将供试物分散在蔗糖溶液中，用以饲喂受试蜜蜂，饲喂4h后更换为不含供试物的 蔗糖溶液并测定含供试物饲料的消耗量。 b): 接触暴露。将1μL受试物药液点滴在受试蜜蜂的中胸背板处,将蜜蜂转人试验笼中,用脱脂 棉浸泡适量蔗糖水饲喂。 5.2.6剂量效应试验 根据最大危害暴露量试验结果,按一定比例间距设置5组～7组供试物系列浓度,将受试蜜蜂暴露 于不同浓度的供试物下，试验开始后，每日对受试蜜蜂的中毒症状、死亡等进行观察和记录。求出试验 结束时供试物对蜜蜂的LDso值或IDso值及其95%置信限。 3 NY/T 3152. 2—2017 5.2.7致死(病)验证试验 在无菌条件下解剖死蜂或病蜂,分离感染组织并接种至适合的培养基质中,将培养物置于适宜目标 菌株生长条件下培养，分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目 标菌株后，再以相同暴露途径感染健康的受试蜜蜂。如果受试蜜蜂出现与先前试验相同的病症，则证实 目标菌株对蜜蜂具有致死(病)能力。 5.3数据处理 5.3.1统计方法选择 试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适 的统计方法。 5.3.2差异显著性检验 5.3.2.1概述 差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析(One-WayANOVA,LSD检验)等。 显著水平取p<0.05（差异显著）、<0.01（差异极显著）。 5.3.2.2独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。 ..(1) , + o n-1 式中: X1,X, 分别为两样本平均数； 分别为两样本方差； n 样本容量。 5. 3. 2. 3 One-Way ANOVA 方差分析(LSD 检验) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。LSD检验按式(2)计算。 LSD。 = ta(df.) Ss,--; (2) 式中： ta(df.) 在F检验中误差自由度下,显著水平为α的临界t值； St;一; 均数差异标准误,按式(3)计算。 Ss,号, = /2MS./n (3) 式中： MS。- F检验中误差均方； n 各处理重复数 5.3.3半数致死量或半数感染量计算 蜜蜂半数致死量LD5o或半数感染量ID5o的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估 算，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。具体计算方法见GB/T31270.10。 5.4质量控制 试验结束时，空白对照组受试蜜蜂死亡率不得超过20%。 6试验报告 试验报告应包括下列内容： 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号； 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况； NY/T 3152.2—2017 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期； 试验摘要； 供试物基本信息（例如，含量和组成信息，以及任何