ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3152.1-2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第1部分：鸟类毒性试验 Risk assessment test guidelines for microbial pesticide- Part 1:Avian toxicity test 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3152.1—2017 前言 NY/T3152《微生物农药环境风险评价试验准则》分为6个部分： -第1部分：鸟类毒性试验； 第2部分：蜜蜂毒性试验； 第3部分：家蚕毒性试验； 第4部分：鱼类毒性试验； 一第5部分：蚤类毒性试验； 第6部分：藻类生长影响试验。 本部分为NY/T3152的第1部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部种植业司提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。 本部分主要起草人：程燕、曲、卜元卿、周艳明、张俊、吴声敢、单正军。 I NY/T 3152.1—2017 微生物农药 环境风险评价试验准则 第1部分：鸟类毒性试验 1范围 本部分规定了微生物农药对鸟类毒性试验的材料、条件、试验操作、质量控制、试验报告等的基本 要求。 2规范性引用文件 下列文件对于本 文件 的应用是 期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用 最新版本 包括所有的修改单)适用于本 化学农药 毒胜试 GB/T31270 境安全评 SEARCH S 3 术语和定义 下列术语和定义 适用于 本文件 3. 1 R 微生物农药 hicrobial pesticid 是以细菌、真 病毒利 等活件 、草、鼠等 有害生物作用的生 农药。 3 3. 2 试验中需要测 3. 3 菌落形成单位 colony forming unit, CFU 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落 3. 4 细菌芽孢、真菌孢子、细菌或原生动物孢囊 bacterial or fungal spore and d bacterial or protozoan cyst 显微镜下一个完整的个体芽孢、孢子或孢囊,通常是指能在合适的培养基上形成单个CFU的一个 完整的实体。 3.5 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU 的实体。 3. 6 原生生物protozoa 原生生物门各个成员的一个完整的营养体、孢子或孢囊。 3.7 病毒virus 显微镜下一个完整的病毒颗粒或包涵体。 NY/T 3152. 1—2017 3. 8 最大危害暴露量maximum hazard exposure level 微生物农药有效成分在环境中对非靶生物可能产生危害的最大暴露量，通常以预测暴露量与安全 系数的乘积来表示。 3. 9 毒性 toxicity 微生物和/或毒素引起受试生物中毒或病变的能力，其作用过程不一定同时发生微生物的感染、复 制和生命活动。 3. 10 致病性 pathogenicity 微生物感染宿主后,在宿主体内存活及繁衍，对宿主造成损伤或病变的能力，通常与宿主的耐受性 或敏感性有关。 3. 11 半数致死量 median lethal dose or concentration, LDs./LCso 在规定时间内,通过指定感染途径,使一定体重或年龄的受试生物半数死亡所需最小微生物数量或 毒素量。 3. 12 半数感染量median infective dose or concentration, IDs./ICso 在规定时间内，通过指定感染途径，使一定体重或年龄的受试生物半数感染所需最小微生物数量或 毒素量。 4试验概述 在一定试验条件下,以一定的供试物浓度或剂量测试对受试鸟的致死毒性和致病性等影响。当供 试物最大危害暴露量试验出现对受试生物50%及以上的个体死亡或致病时，则还需进行剂量效应试验 和致死(病)验证试验。致死毒性以 LDso表征;致病性以 IDso值表征。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1试验生物 推荐物种为日本鹤鹑（Coturnia coturnix japonica）、野鸭（Anas platyrhynchos）、北美鹤（Coli- nus uirginianus）、鸽子(Columba livia)等的幼鸟（孵化后 14 d～24 d,且试验开始时受试鸟之间体重差 别不超过10%。受试鸟健康状况良好，引入实验室后7d内的死亡率应<5%。 5.1.2供试物 5.1.2.1类型 微生物母药、制剂产品等。 5.1.2.2批次 通常情况下，试验中供试物应采用同一批次的产品。但在不得不使用另一批次产品时，应在试验报 告中记录供试物的批次。 5.1.2.3计数方法 计数方法如下： 细菌可采用稀释平板菌落计数法、荧光定量PCR等测定； -真菌孢子以CFU为计数单位,可采用稀释平板菌落计数法或血球计数板法等测定； 2 NY/T 3152. 1—2017 原生动物以个体数目为计数单位，可采用血球计数板法等测定； 病毒以包涵体等感染单位为计数单位,可采用荧光定量PCR、血球计数板法等测定； 一其他单位，根据微生物的类型和特性选择最适当的计数方法。 以上推荐计数方法,参见附录 A、附录 B、附录 C。 5.1.3主要仪器设备 超净工作台。 灭菌锅。 显微镜。 解剖镜。 分光光度计。 聚合酶链式反应仪。 试验用鸟笼。 温湿度计。 玻璃容器。 天平等。 5.1.4试验条件 日本鹤 养温度 2 /鸟; 鹦饲 相对湿度 ，饲养空间不 m 野鸭饲养温 度双22 28% 相对湿度 养空间不得小手 鸟 -北美鹑饲养温度 28℃，相对湿度 F50 饲养空间不得 /鸟; 鸽子饲养温 度为 相对湿度 50% 6.饲养空间不得小 5.2试验操作 CEN 5.2.1暴露途径 根据供试物特性 5.2.2处理组和对照 试验设置供试 理组 照组。 可不设 行 对半。考虑微 生物的传染性,各处理 及对照 5.2.3效应观察 人 试验期间每日对受试鸟的饲料食用状况行为异常死亡 等进行观察和记录 鸟类不对刺激产生 反应时认为鸟已死亡。 5.2.4试验周期 通常试验观察时间应持续30d。 当在试验观察时间末期,处理组受试鸟开始出现死亡或明显病征， 则需延长观察时间,直至能够判断供试物对受试鸟的最终影响 5.2.5最大危害暴露量试验 以下列不同暴露途径设置供试物最大危害暴露量。当因制剂剂型等条件限制，供试物溶液浓度不 能达到最大危害暴露量时，则以供试物在水中能配制到的最大浓度进行试验。试验开始后，每日观察并 记录受试鸟的中毒症状及死亡情况。当受试鸟在试验期间未发生死亡(病变)或死亡(病变)率不超过 50%,则无需进行剂量效应试验和致死(病)验证试验。经口暴露和腹腔注射暴露的暴露量计算如下： a) 经口暴露量。最大危害暴露量按式(1)计算。 Dosemax=CXVoral XW (1) 式中： Dosemax 最大危害暴露量，单位为微生物数量（units)； 3 NY/T 3152. 1—2017 C 供试微生物农药配制浓度，单位为微生物数量每毫升（units/mL); Voral——受试鸟单位体重经口暴露时摄入农药体积,单位为毫升每千克(mL/kg),取值为5mL kg; W 一—受试鸟体重,单位为千克(kg)。 供试微生物配制浓度为1.0×108单位/mL，或按供试微生物农药推荐施用浓度的10倍计算（两者 均能达到时，取较高值为配制浓度）。以此经口最大危害暴露量连续5d经口给药，然后正常饲喂直至 试验结束。 b）腹腔注射暴露量。最大危害暴露量按式(2)计算。 Dosemax =CXVinjection X W (2) 式中： V irjection 受试鸟单位体重经口腹腔注射时摄人农药体积，单位为毫升每千克（mL/kg），取值为2 mL/kg. 供试微生物农药配制浓度为1.0X10°单位/mL,或按供试微生物农药推荐施用浓度的10倍计算 (两者均能达到时,取较高值为配制浓度）。以此腹腔注射最大危害暴露量一次性腹腔注射，然后正常饲 喂直至试验结束。 5.2.6剂量效应试验 根据最大危害暴露量试验结果,按一定比例间距设置5组～7组供试物系列浓度,将受试鸟暴露于 不同浓度的供试物下。试验开始后，每日观察并记录受试鸟的中毒症状及死亡情况,求出试验结束时供 试物对受试鸟类的 LDso或 ID5o及其 95%置信限。 5.2.7致死(病)验证试验 在无菌条件下解死鸟或病鸟,分离感染组织并接种至适合的培养基中,将培养物置于适宜目标菌 株生长条件下培养,分离纯化疑似菌株，疑似菌株经形态学、生理生化及核酸等方法鉴定并确认为目标 菌株后,再以相同暴露途径感染健康的受试鸟。如果受试鸟出现与先前试验相同的病症，则证实目标菌 株对鸟类具有致死(病)能力。 5.3数据处理 5.3.1统计方法选择 试验结果的数据处理可选择5.3.2、5.3.3中所述的统计学方法，也可根据试验情况选择其他合适 的统计方法。 5.3.2差异显著性检验 5.3.2.1概述 差异显著性检验推荐采用独立样本t检验或单因子方差分析(One-WayANOVA，LSD检验)等。 显著水平取p<0.05(差异显著)、p<0.01(差异极显著)。 5.3.2.2独立样本t检验 2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(3)计算。 Xi