ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3146—2017 动物尿液中22种β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of 22 β-agonists in animal urines- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS) 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3146—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)]。 本标准主要起草人：王培龙、索德成、范理、王瑞国、李阳、张维、宋荣、张苏、苏晓鸥、李宏、周炜、冯三 令、耿士伟、黄士新。 I NY/T 3146—2017 动物尿液中22种β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了动物尿液中22种β-受体激动剂含量测定的液相色谱-串联质谱方法。 本标准适用于猪尿液、牛尿液和羊尿液中克仑特罗（Clenbuterol）、沙丁胺醇（Salbutamol）、莱克多 巴胺（Ractopamine）、齐帕特罗（Zilpaterol）、氯丙那林（Clorprenaline）、特布他林（Terbutaline）、西马特 罗（Cimaterol)、西布特罗（Cimbuterol）、马布特罗（Mabuterol）、溴布特罗（Brombuterol）、班布特罗 (Bambuterol)、克仑普罗(Clenproperol)、妥布特罗( lobuterol)、利托君(Ritodrine)、沙美特罗（Salme- terol)、喷布特罗(Penbuterol) thanolamine A）、异克舒 立贝特罗(Labetalol)22种β-受 体激动剂的测定。 AING 本标准方法检出限为 0. N 2规范性引用文 下列文件对 文件的 用是必不可少的。凡是注日期的引用文件, 的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文 件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文 GB/T 6682 分析实 室用水规格和试验方法 JRA 3原理 尿液样品经 解处 子固相萃取柱净化、吹干、稀释液溶解， 目色谱-串联质谱 仪检测，内标法定 CET 4试剂和材料 除非另有说明 所用试齐 个析纯试剂， 及水的规定。 4.1甲醇：色谱纟 GR 4.2甲酸:色谱级 4.3乙腈：色谱纯。 人 4.4试样稀释液：取甲酸(4 2)0. 1 mL 0m j90mL水混习。 4.6高氯酸溶液:取30mL高氯酸 70 mL水混合。 4.70.2mol/L乙酸铵提取液(pH 2）：取（ g,用水溶解并稀释至1000 mL,用冰乙酸调 pH至5.2。 4.8氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠10g,溶于100mL水中。 4.9β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶,活性≥85000 U/mL。 4.10β-受体激动剂对照品（克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特 罗、西布特罗、马布特罗、溴布特罗、班布特罗、克仑普罗、妥布特罗、利托君、沙美特罗、喷布特罗、马喷特 罗、福莫特罗、苯乙醇胺A、异克舒令、克伦塞罗、拉贝特罗）、β-受体激动剂内标对照品（氯丙那林-D7、 西马特罗-D7、西布特罗-D9、沙丁胺醇-D3、马布特罗-D9、克仑普罗-D7、莱克多巴胺-D3、克仑特罗 D9、苯乙醇胺A-D3、沙美特罗-D3):纯度≥97%。 1 NY/T 3146—2017 4.11β-受体激动剂标准储备液：精密称取各种β-受体激动剂对照品至棕色容量瓶中，用甲醇(4.1)配 成浓度各为1mg/mL的标准储备液,2℃～8℃冷藏保存,有效期12个月。 4.12β-受体激动剂标准工作液：分别吸取各种β-受体激动剂标准储备液（4.10),用0.2%甲酸水溶液 (4.3)稀释成浓度为1μg/mL的标准工作液。2℃～8℃冷藏保存,有效期3个月。 4.13β-受体激动剂内标储备液：精密称取各种β-受体激动剂内标对照品至棕色容量瓶中，用甲醇 (4.1)配成浓度各为1mg/mL的标准储备液，2℃～8℃冷藏保存，有效期12个月。 4.14β-受体激动剂内标工作液：分别吸取各种β-受体激动剂内标储备液,用0.2%甲酸水溶液(4.3) 稀释成浓度为1μg/mL的标准工作液。2℃～8℃冷藏保存，有效期3个月。 4.15氮气：纯度99.9%。 4.16固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱(3mL,60mg）,或其他性能类似的小柱。 4.17滤膜:0.22μm,有机系。 51 仪器和设备 5.1 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾电离源。 5.2氮吹仪或旋转蒸发仪。 5.3离心机：转速不低于8000r/min。 5.4涡旋振荡器。 5.5恒温水浴摇床。 5.6固相萃取装置。 5.7天平：感量0.00001g。 6试样的保存 样品应置于一18℃保存，测试有效期不超过3个月，分析前放置至室温，如有浑浊，离心后取上清液 备用。 7 分析步骤 7.1酶解 精确吸取试样10mL于50mL离心管中，用高氯酸溶液（4.6)或氢氧化钠溶液（4.8)调节试样pH 至5～7之间。准确加人10mL乙酸铵溶液（4.7)、50μLβ-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶和10μL内标 工作液（4.14）。涡旋混合30s，于37℃振荡水解过夜（应大于16h），加人1.0mL高氯酸溶液（4.6），涡 旋混合30s，然后于8000r/min离心5min，上清液备用。 7.2净化 固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。取适量或全部上清液过柱，用3mL水和3mL甲 醇淋洗，抽干，用3mL氨水甲醇溶液（4.5)洗脱，收集洗脱液。洗脱液用氮吹仪在50℃条件下吹干，用 1.0mL样品稀释液（4.4)溶解，过0.22μm滤膜。如检测含量超出线性范围（1.0μg/L～100μg/L),应 适当减少过固相萃取小柱的溶液量,将上机溶液所含药物的浓度稀释至线性范围（1.0μg/L100μg/ L)内上样。 7.3参考液相色谱条件 色谱柱：C1g柱，柱长150mm，内径3.0mm，粒径1.7μm(或其他效果等同的Cl8柱）。 柱温：30℃。 进样量：10μL。 2 NY/T 3146—2017 流动相及参考梯度洗脱程序见表1。 表1流动相及参考梯度洗脱程序 时间,min 流速,mL/min 0.1%甲酸溶液，% 乙腈,% 0 0. 3 95 5 1. 0 0. 3 95 5 2. 0 0. 3 80 20 6. 0 0. 3 70 30 7. 0 0. 3 10 90 8. 0 0. 3 10 06 9. 1 0. 3 95 5 10 0. 3 95 5 7. 4 参考质谱条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子模式。 检测方式：多反应监测。 脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏 度达到检测要求。 毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度。 定性离子对、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。 表 2 22种β-受体激动剂及内标的定性离子对、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量的参考值 被测物名称 定性离子对，m/2 定量离子对，m/ 锥孔电压，V 碰撞能量,eV 213.9>153.9 32 氯丙那林 213.9>153.9 26 213.9>90.9 16 220.1>202.1 16 西马特罗 220.1>202.1 23 220.1>160.0 10 226.0>152.0 20 特布他林 226.0>152.0 25 226.0>170.0 20 228.0>154.0 20 妥布特罗 228.0>154.0 26 228.0>172.0 20 234.0>160.0 15 西布特罗 234.0>216.0 25 234.0>216.0 9 240.0>148.0 20 沙丁胺醇 240.0>148.0 25 240.0>222.0 10 262.2>185.0 24 齐帕特罗 262.2>185.0 24 262.2>244.0 13 263.1>203.1 18 克仑普罗 263.1>203.1 22 263.1>245.2 11 277.0>203.0 20 克仑特罗 277.0>203.0 25 277.0>259.0 10 288.0>150.0 20 利托君 288.0>150 19 288.0>121.2 20 292.2>236.2 20 喷布特罗 292.2>236.2 22 292.2>209.2 15 302.0>150.0 20 异克舒令 302.0>150 22 302.0>107.0 20 302.2>163.9 16 莱克多巴胺 302.2>163.9 20 302.2>284.2 12 3 NY/T 3146—2017 表2 (续) 被测物名称 定性离子对,m/ 定量离子对，m/ 锥孔电压，V 碰撞能量，eV 310.9>236.9 24 马布特罗 310.9>236.9 30 310.9>216.9 16 319.1>202.9 20 克伦塞罗 319.1>202.9 22 319.1>301.1 13 325.2>237.0 15 马喷特罗 325.2>237.0 19 325.2>307.1 15 拉贝特罗 329.0>20