ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3144—2017 饲料原料 血液制品中18种β－受体激动 剂的测定氵 液相色谱一串联质谱法 Determination of 18 β-agonists in blood products feedstuff- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3144—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 (北京)。 本标准主要起草人：索德成、王培龙、李阳、王瑞国、苏晓鸥、樊霞、周炜、冯三令、李宏。 NY/T 3144—2017 饲料原料血液制品中18种β-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料原料血液制品中18种β-受体激动剂测定的液相色谱-串联质谱法。 本标准适用于血球蛋白粉、水解血粉、血球蛋白粉、血粉、发酵血粉中克仑特罗（Clenbuterol)、沙丁 、氯丙那林（Clorprenaline）、特布 他林（Terbutaline）、西马 特罗（C 布特罗（Mabuterol）、溴布特罗 (Brombuterol）、班布特 寺罗（ Tulobuterol)、利托君 (Ritodrine）、沙美特罗（Sa lmeterol) 仑塞罗福莫特罗（Formo ote 股 A(Phenylethanolamine A)18种β-受体激动剂 的测定。 RESE 本标准方法格 限为Y kg,定量限为 5μ S 2规范性引用文件 下列文件对 本文件 的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件,仅 版本 适用于本文 件。凡是不注日 期的引用 文件，其最 包括所有的修 于本文佳 RCH 分析 GB/T 6682 验室用水规格和试验方法 GB/T 14699 料 GB/T 20195 动物 CET 3原理 饲料原料血液制 酶解处 释液溶解，液相色 谱-串联质谱仪检测 基属添 4试剂 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯试剂,实验室用水符合GB/T 6682中一级水的规定。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2甲酸：色谱级。 4.3乙酸铵提取液(pH=5.2):取乙酸铵15.4g,用1000mL k溶解，用乙酸调pH至5.2。 4.4样品稀释溶液：取甲酸0.1mL,乙腈10mL,加水90mL,混匀。 4.5氨水甲醇溶液:取5mL氨水与95mL甲醇混合。 4.6高氯酸溶液：取30mL高氯酸与70mL水混合。 4.7克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、齐帕特罗、氯丙那林、特布他林、西马特罗、西布特罗、马布特罗、 溴布特罗、班布特罗、克仑普罗、妥布特罗、利托君、沙美特罗、克仑塞罗、福莫特罗和苯乙醇胺A对照 品：纯度98%。 4.8β-受体激动剂标准储备液：分别精密称取各种β-受体激动剂对照品至棕色容量瓶中，用甲醇配成 浓度为1mg/mL的标准储备液,2℃～8℃冷藏保存,有效期12个月。 4.9β-受体激动剂标准工作液：分别精密吸取各种β-受体激动剂储备液（4.8），用样品稀释溶液稀释 1 NY/T 3144—2017 成浓度为1μg/mL的标准工作液。2℃～8℃冷藏保存，有效期3个月。 4.10β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶:β-盐酸葡萄糖醛苷酶≥85000u/mL。 4.11氮气：纯度99.9%。 4.12固相萃取小柱：混合型阳离子交换柱（3mL60mg）,或其他性能相当的小柱。 4.13滤膜：0.22μm，有机材质。 5仪器和设备 5.1液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾电离源。 5.2氮吹仪。 5. 3离心机:转速不低于 8 000 r/min。 5.4粉碎机。 5. 5 5涡旋振荡器。 5.6恒温水浴振荡摇床。 5.7 固相萃取装置。 5.8天平：感量0.01g;感量0.00001g。 6采样和试样的制备 按GB/T14699.1的规定抽取有代表性的样品，用四分法缩减取样，按照GB/T20195的规定制备 样品，粉碎过0.45mm孔径筛，混合均匀,装入磨口瓶中备用。 7分析步骤 7.1提取 称取2g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中，准确加入20mL乙酸铵提取液（4.3)和50μLβ 葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶37℃水解过夜（应大于16h），然后于8000r/min离心5min，将10mL上 清液转移至另一离心管中，加入1.0mL高氯酸溶液，涡旋混合30s，然后于8000r/min离心5min，上 清液备用。 7.2净化 固相萃取小柱依次用3mL甲醇、3mL水活化。取适量或全部上清液过柱，用3mL水和3mL甲 干，用1.0mL样品稀释液（4.4)溶解，过0.22μm滤膜。如果检测含量超出线性范围（1μg/L～100μg/ L），应适当减少称样量重新处理或减少过固相萃取小柱的溶液量，将上机溶液所含药物的浓度稀释至 线性范围内上样。 7.3空白基质曲线的制备 选取待测样品类型相同的空白血粉样品，称取6份或2份双平行，每份2g（精确至0.01g），于50 mL离心管中，按7.1和7.2步骤处理，在净化、吹干后的残渣中，分别添加适量的混合标准工作溶液， 配制成不同浓度（1ug/L～100ug/L）的基质添加标准曲线或双平行单点标准溶液，供液相色谱-串联质 谱测定，进行定量。 7.4参考液相色谱条件 色谱柱：Cl8柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径1.7μm（或其他效果等同的Ci8柱）。 柱温：30℃。 进样量：10μL。 2 NY/T 3144—2017 流动相及参考梯度洗脱程序见表1。 表 1 流动相及参考梯度洗脱程序 时间，min 流速，mL/min 0.1%甲酸溶液，% 乙腈,% 曲线 0 0. 3 95 5 6 1. 0 0. 3 95 5 6 2. 0 0. 3 80 20 6 6. 0 0. 3 70 30 6 7. 0 0. 3 10 90 6 8. 0 0. 3 10 06 6 9. 1 0. 3 95 5 6 10 0. 3 95 5 6 7.5 参考质谱条件 离子源：电喷雾离子源。 扫描方式：正离子模式。 检测方式：多反应监测。 脱溶剂气、锥孔气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏 度达到检测要求。 毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最佳灵敏度， 定性离子对、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。 表 2 218 种β-受体激动剂的定性离子对、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量的参考值 被测物名称 定性离子对，m/z 定量离子对，m/2 锥孔电压，V 碰撞能量,eV 220.1>202.1 10 西马特罗 220.1>202.1 16 220.1>160.1 16 311.1>237.1 16 马布特罗 311.1>237.1 26 311.1>217. 1 25 234.2>162.0 16 西布特罗 234.2>162.0 23 234.2>216.2 10 367.0>293.0 19 溴布特罗 367.0>293.0 25 367.0>349.0 12 302.4>164.4 17 莱克多巴胺 302.4>164.4 26 302.4>284.4 13 214.0>154.1 17 氯丙那林 214.0>154.1 25 214.0>196.1 12 226.3>152.3 17 特布他林 226.3>152.3 25 226.3>170.3 12 262.3>244.3 13 齐帕特罗 262.3>244.3 24 262.3>185.3 24 240.3>148.3 20 沙丁胺醇 240.3>148.3 22 240.3>222.3 10 277.0>203.0 17 克仑特罗 277.0>203.0 25 277.0>259.0 11 262.8>244.9 14 克仑普罗 262.8>202.8 19 262.8>202.8 16 227.8>153.7 14 妥布特罗 227.8>153.7 19 227.8>171.7 9 367.9>71.7 30 班布特罗 367.9>294.0 25 367.9>294.0 17 3 NY/T 3144—2017 表2(续 被测物名称 定性离子对，m/2 定量离子对，m/2 锥孔电压，V 碰撞能量，eV 苯乙醇胺A 345.1>150.0 30 345.1>150.0 22 345.1>327.0 17 345.2>149.0 福莫特罗 30 345.2>327.0 345.2>149.0 22 17 利托君 288.2>270.1 12 288.2>270.1 20 288.2>121 24 319.1>202.9 克仑塞罗 20 319.1>202.9 22 319.1>301.1 13 沙美特罗 416.2>380.3 18 416.2>398.3 416.2>380.3 30 15 7.6 定性测定 PUB 每种被测组分选择 个母离 下，样品中待测物质的保留时间 与混合标准溶液中对应 定性 离子的相对丰度与浓 度接近的标准溶液中 对应 定性离 1相对丰度 比较,若偏 规定 的范围,则可判定为 样品中存在对应的 待测 度的最大允许 单位为百分率 相对离子丰 10～