ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3141—2017 饲料中26-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4- 二氢吡啶的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of 1 , 4-dihydro-2, 6-dimethyl-3 , 5-pyridinedicarboxylic acid diethyl ester in feeds-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2017-12-22 发布 2018-06-01 实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3141—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（成都）。 本标准主要起草人：赵立军、张静、李宏、林顺全、廖峰、曾晓芳、魏敏、李云 NY/T 3141—2017 饲料中 2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶的测定 液相色谱一串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中2,6-二甲基-3,5 二氢吡啶含量测定的液相色谱一串联质 谱法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中2,6-二甲基-3,5-二乙酯 基-1,4-二氢吡啶的测定 2规范性引用文件 Q 下列文件对于 本文 牛的应用 J少的。 凡是注日期的 用文 日期的版本适用于本文 件。凡是不注日 的 用义件 其最新版本(包括所 所有的修改单)适用于 析的验 GB/T 668 用水规格和试验方 GB/T14699 饲料 采样 GB/T 20 动物 试样的制 URA 3原理 试样中的 12 二氢吡啶经提取,固相萃取 后用高效液相色 定，外 谱一串联质谱仪测 4试剂和材料 除非另有说 明 规定白 4.1甲醇：色谱纟 GRI 4.2乙晴：色谱纯 4.3 乙酸铵：色谱纯 4. 4 甲酸：色谱纯。 4.595%甲醇溶液:取甲醇( 1)95mL加水 100 mL, ，即得 4.6 90%乙腈溶液:取乙腈(4.2)90 mL加水定容至 100mL,摇匀,即 4.72 2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1, 98.0% 4.8标准储备溶液：准确称取适量2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶对照品（精确到0.1 mg），用乙腈溶解、定容，配成储备溶液浓度为1mg/mL,转移至棕色瓶。一20℃冰箱内保存，有效期为 3个月。 4.9标准中间溶液：准确吸取2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶储备溶液（4.8)0.2mL,用乙 腈稀释、定容至100mL，使之浓度为2.0μg/mL,转移至棕色瓶。一20℃冰箱内保存，有效期为1个月。 4.100.1%甲酸+5mmol/L乙酸铵水溶液：称取乙酸铵（4.3)0.385g加水定容至1000mL，加入甲酸 (4.4)1mL,摇匀，即得。 4.11固相萃取柱：Ci8固相萃取柱(200mg/3mL);或性能相当的分析柱。 1 NY/T 3141—2017 4.12微孔滤膜：0.22μm，有机相。 4.13密封盖塑料离心管：50mL。 5仪器和设备 5.1高效液相色谱一串联质谱仪(配电喷雾离子源)。 5.2分析天平：感量为0.1mg和0.01g各1台。 5.3离心机:转速为8000 r/min及以上。 5.4超纯水器。 5.5涡旋混合器。 5.6振荡器。 5.7固相萃取装置。 6采样和试样制备 按照GB/T14699.1的规定抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195的规 定制备试样，全部通过0.28mm孔筛，充分混匀，装入密闭容器中，避光低温保存，备用。 7 分析步骤 7.1提取 中，加人95%甲醇（4.5)50mL。置于振荡器上中速振荡30min，静置2min。移取适量上清液于离心 管中，以8000r/min离心5min。准确吸取上清液0.2mL,用95%甲醇（4.5）定容至10mL，作为备 用液。 7.1.2添加剂预混合饲料：准确称取1g(精确到0.01g),置于250mL具塞锥形瓶中,加人90%乙腈 （4.6)50mL。置于振荡器上中速振荡30min，静置2min。移取适量上清液于离心管中，以8000r/min 离心5min。准确吸取上清液0.1mL，用90%乙（4.6)定容至10mL，作为备用液。 7.2净化 7.2.1配合饲料、浓缩饲料或精料补充料：固相萃取柱依次用甲醇3mL、水3mL活化（活化后萃取柱 内水相液面高于柱筛板1mm～2mm),取备用液(7.1.1)3.0mL过柱,收集流出液至10mL试管内,涡 旋混匀，过0.22μm滤膜。 7.2.2添加剂预混合饲料：取适量备用液（7.1.2)，过0.22μm滤膜。 7.3标准曲线的制备 根据测定试样种类不同，按7.1和7.2步骤分别制备配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预 混合饲料空白试样备用液。精密量取适量2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶标准中间溶液 （4.9），用上述空白试样备用液稀释定容，制得0.0004μg/mL、0.002μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/ mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL各系列工作溶液，供高效液相色谱一串联质谱测定。 7.4测定 7.4.1液相色谱参考条件 色谱柱:Ci8柱,柱长100mm，内径2.1mm,粒径2.4μm;或性能相当的分析柱； 流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸十5mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱条件见表1; 柱温：30℃； 进样量：10μL。 2 NY/T 3141—2017 表1流动相梯度洗脱参考条件 时间，min 流动相 A,% 流动相B,% 流速，mL/min 20.0 0 80.0 0. 20 2. 00 80.0 20. 0 0. 20 5. 00 80.0 20.0 0. 20 5. 01 95. 0 5. 00 0. 40 12. 00 95.0 5. 00 0. 40 12. 01 20.0 80.0 0. 20 15.00 20.0 80.0 0. 20 7.4.2质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源； 扫描方式：正离子扫描； 检测方式：多反应监测； 毛细管电压、碰撞能量等参数应优化至最佳灵敏度； 定性离子对、定量离子对等参数见表2。 表 2 2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶的定性、定量离子对及碰撞能量参考值 名称 定性离子对,m/2 定量离子对，m/z 碰撞能量，V 2,6-二甲基-3,5-二乙酯 254/208 6 254/208 基-1,4-二氢吡啶 254/108 22 7.4.3定性测定 在相同试验条件下，试样中待测物的保留时间与标准工作溶液的保留时间偏差在士2.5%以内，且 试样谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准工作溶液中对应的定性离子相对离子丰 度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定试样中存在对应的待测物。 表 3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 单位为百分率 相对离子丰度 >50 20～50(含) 10~20（含） ≤10 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.4.4定量测定 积定量。当待测物浓度超出线性范围时，应适当调整稀释倍数后测定。2,6-二甲基-3,5-二乙酯基 1,4-二氢吡啶标准工作溶液多反应监测(MRM)色谱图参见附录A。 8 结果计算 试样中2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶的含量X,以质量分数表示,单位为毫克每千克 (mg/kg),单点校正按式(1)计算。 AsXmXV 式中: X 试样中26-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶含量，单位为毫克每千克（mg/kg)； A, 试样溶液峰面积值； Cs 标准工作溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)； Vs- 标准工作溶液进样体积，单位为微升（μL)； 3 NY/T 3141—2017 V 定容体积,单位为毫升(mL)； As 标准工作溶液峰面积值； m 称取试样的质量，单位为克(g)； V- 试样溶液进样体积,单位为微升(μL)； 稀释倍数。 测定结果用平行测定的算术平均值表示,结果保留3位有效数字。 多点校正按式(2)计算。 m 式中： Cx 标准曲线上查得的试样中2,6-二甲基 3.5 二乙酯基- 氢吡啶的浓度，单位为微克 每毫升（μg/mL PL B 测定结果用平行测定的算术平 9 重复性 在重复性条件 结果的绝对差值不 的算术平均值的20%。 NY/T 3141—2017 附录A (资料性附录) 2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶标准溶液多反应监测(MRM)色谱图 × 102 [4.89 1.3 494 1.2 2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶 1.1 1 0.9 0.8 L0 0.6 0.5 × 102 J4.89 4.5 2.245 4 3.5 —2,6-二甲基-3,5-二乙酯基-1,4-二氢吡啶 3 2.5 2 1.5 1 0.5 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 t,min 图A.1 2,6 -二甲基-3,5-二 乙酯基-1,4 二氢吡啶标准溶液(5.0ng/mL)多反应监测(MRM)色谱图 : 5