ICS 67.100.10 X 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3130—2017 生乳中L一羟脯氨酸的测定 Determination of L-hydroxyproline in raw milk 2017-12-22 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3130—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会(SAC/TC274)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业部奶产品质量安全风险评估实验室 (北京)、安徽农业大学、青岛农业大学、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。 本标准主要起草人：郑楠、叶巧燕、文芳、李松励、许晓敏、刘萍、甄云鹏、屈雪寅、杨永新、韩荣伟、程 建波、张养东、王加启。 I NY/T 3130—2017 生乳中L-羟脯氨酸的测定 1范围 本标准规定了生乳中L-羟脯氨酸的测定方法。 本标准适用于生乳中L-羟脯氨酸的测定。 本标准检出限为30mg/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。儿是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引 本文化 GB/T 6682 分析实驴 验室用水规格和试验方 ING TAND 3原理 S 样品经酸水角 ,游离 的L-羟脯氨酸用氯胺 I氧化,生成含有吡咯环 成物与对二甲 胺基苯甲醛 化合物,在波长 560 nm处测定吸光度，与标准系列 RA 4 试剂和材料 除非另 有说 明石 为分析纯的试剂,水为 GB/T 6682 级水。 工 4.1盐酸() C 4.2盐酸溶液 4.3缓冲溶液 g 柠檬酸（C6H.Oz VaOH) 46.1g乙酸钠 (NaO,C, H3)溶 至 混匀。 4.4氯胺T溶 依次 CNN mL水 10mL正丙醇和 80mL缓冲溶液（ 昆习， 4.5显色剂：称取 对 CIO4）溶解，缓慢加入 65 mL异丙醇(CsH12C 习，现用现配 4.6氢氧化钠溶液(10 mol) ：准确称量 og 氧化钠,用水溶解冷 却后定容至100mL。 4.7氢氧化钠溶液(1mol/ 确称量 4. 0 g氢氧化钠,用水溶解 容至100mL。 4.8L-羟脯氨酸标准储备液（500mg/ 羟脯氨酸标准品（C,H,NO3,CAS:51 35-4,纯度≥99.0%）,用0.02mol/L盐酸溶液 睿解，定容至100mL。于4℃冰箱内储存，有效期 6个月。 4. 9 L-羟脯氨酸标准工作液(5. 00 mg/ L):准确吸取标准储备液(4. 8)1. 00 mL于100mL容量瓶中, 用0.02mol/L盐酸溶液(4.2)定容至刻度,现用现配。 5仪器 5.1分析天平：感量0.1mg。 5.2三角瓶：容量100mL,长颈，小口。 1 NY/T 3130—2017 5.3电热恒温干燥箱：土1℃。 5.4定性滤纸：直径11cm。 5.5容量瓶：50mL、100mL。 5.6具塞比色管：10mL、25mL。 5.7 酸度计。 5.8恒温水浴锅：±1℃。 5.9分光光度计：可调波长560nm。 5.10比色皿：光程为1cm。 5.11玻璃水解管：配有聚四氟乙烯密封盖。 6 分析步骤 6.1水解样品 准确吸取5.00mL混匀的生乳样品于玻璃水解管（5.11)中，加5.00mL盐酸（4.1)摇匀密封后，置 于110℃电热恒温干燥箱（5.3）中水解12h（加热1h后取出，轻轻摇动玻璃水解管），取出冷却。摇匀 后，打开玻璃水解管，用滤纸（5.4）过滤至100mL容量瓶中，用水反复冲洗玻璃水解管和漏斗，定容至刻 度,摇匀。吸取5.00mL～25.00mL(视水解液中L-羟脯氨酸的含量)水解液于100mL三角瓶中。用 浓度为10mol/L和1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0土0.2,转移到100mL容量瓶中，用水定容至 刻度，摇匀，作为试液备用。 6.2测定 6.2.1标准曲线的绘制 mL分别置于100mL容量瓶中，用水定容，摇匀。浓度分别为0.00mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、 0.20mg/L、0.50mg/L和1.00mg/L。取上述不同浓度的溶液各5.00mL，分别加人至25mL具塞比 色管中，加入氯胺T溶液(4.4)2.00mL，摇匀后于室温放置20min，加人显色剂（4.5)2.00mL,摇匀，塞 上塞子于60℃恒温水浴锅中加热20min后取出，迅速置人20℃左右水中冷却，用分光光度计在560nm 波长处测定吸光度值，40min内完成测定，以吸光度值为纵坐标、浓度值为横坐标绘制标准曲线。 6.2.2试液测定 吸取5.00mL试液（6.1)于25mL具塞比色管中，加人氯胺T溶液（4.4)2.00mL,摇匀后于室温放 置20min，加人显色剂（4.5)2.00mL，摇匀。塞上塞子，于60℃恒温水浴锅中加热20min后取出，迅速 置人20℃左右水中冷却。用分光光度计在560nm波长处测定吸光度值，40min内完成测定。同时做 空白试验。 7 计算 样品中L-羟脯氨酸的含量以质量浓度X计，单位为毫克每升（mg/L），按式(1)计算。 (1) AXA 式中： C1 从标准曲线上查得的试液浓度，单位为毫克每升（mg/L）； Vi- 吸取样品的体积，单位为毫升（mL）； V2 样品水解后的定容体积，单位为毫升（mL）； V3 吸取水解液的体积,单位为毫升(mL)； 水解液调完pH定容的体积,单位为毫升(mL)。 2 NY/T 3130—2017 结果保留3位有效数字。 8精密度 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 第二法高效液相色谱法 9原理 样品经酸水解、过滤、氮气吹至近干,稀盐酸溶解,溶液经异硫氰酸苯酯(PITC)衍生生成苯氨基硫 甲酰-羟脯氨酸(PTC-羟脯氨酸),注人液相色谱仪 外标法定量 10 试剂和材料 RD 除非另有说明 分析 中仅使用确认 2中规定的一级水。 10.1 盐酸(HCl 10. 2 甲醇(CH OH :色谱纯 V 10.3 正已烷（ 4)色谱 盐酸溶液 10. 4 L):量取盐酸(10.1 7mL,用水定容至1L 10.5 三乙胺乙 情溶液 %）:准确移取1.4 mL 乙胺（C,HisN）,用乙 色谱纯)定容至 10 mL。 A 10.6异硫氰酸 苯酯之 异硫氰酸苯酯 ),用乙腈定容至 10 mL。 U 10. 7 乙酸铵 液(20 mmol/) 铵(C,H7 定 容至1 L。 10.8 L-羟 酸标准储备 脯氨酸标准 NO3,CAS:51 35-4,纯度 0% 解后定 箱内储存，有效 期6个月。 10. 9 L-羟脯 氨酸 )：准确吸取 氨酸标准储备液(10.8)于 100mL的容量瓶内， 期1周。 仪器 11. 1 液相色谱仪：配有紫外检测器 11. 2 电热恒温干燥箱：土 11. 3 玻璃水解管：配有聚四氟乙烯密封盖 11. 4 2.5mL衍生管。 11.5 分析天平：感量0.1mg。 11. 6 定性滤纸：直径11 cm。 11.7 氮吹仪。 11. 8 涡旋振荡器。 11. 9 恒温培养箱：士1℃。 11. 10 高速离心机：可调15000r/min，15℃。 11. 11 0.45μm水相过滤膜，直径13mm。 3 NY/T 3130—2017 12分析步骤 12.1样品处理 12.1.1准确吸取5.00mL混匀的生乳样品于玻璃水解管（11.3)中，加5.00mL盐酸（10.1）。摇匀密 封后，置于110℃电热恒温干燥箱（11.2）中水解12h（加热1h后取出，轻轻摇动玻璃水解管），取出冷 却。摇匀后，打开玻璃水解管,经滤纸(11.6)过滤。取0.25mL滤液于氮吹仪（11.7)上吹至近干，残留 物用0.50mL0.02mol/L盐酸溶液(10.4)溶解，待衍生化。 12.1.2取上述溶液 0.40mL于衍生管(11.4)中(标准工作液与样品同步衍生),分别加人 0.20 mL 14%三乙胺乙腈溶液（10.5)和0.20mL2.5%异硫氰酸苯酯乙腈溶液（10.6），涡旋混勾，于恒温培养箱 (11.9)中30℃衍生15min。取出后加人0.80mL正已烷（10.3），涡旋30s后于高速离心机（11.10） 15℃，15000r/min离心5min，取下层液体经水相过滤膜（11.11)过滤作为试液。 12.2试液测定 12.2.1色谱参考条件 色谱柱：XBridgeCig（4.6mmX250mm，5μm），或其他相当的色谱柱； 柱温：35℃； 流速：1.00mL/min; 进样体积：10μL； 检测波长：254nm； 流动相A为20mmol/L乙酸铵溶液（10.7),流动相B为甲醇。 注：液相色谱流动相梯度洗脱条件参见附录A中表A.1，也可根据仪器自身条件进行调整。 12.2.2定量测定 将衍生后的标准工作液和试液，注人液相色谱仪。按照保留时间定性，以标准工作液单点或多点进 行校准，并用标准工作液峰面积比较定量。在上述色谱条件下，标准品色谱图参见图A.1。 13结果计算 样品中L-羟脯氨酸的含量以质量浓度X计,单位为毫克每升(mg/L)，按式(2)计算。 (2) Asi XV, XVs 式中: Ai 一 试液中L-羟脯氨酸的峰面积； Csl L-羟脯氨酸标准溶液的浓度,单位为毫克每升(mg/L); V: 氮吹后加人稀盐酸溶液定容的体积,单位为毫升(mL)； V6 水解液的总体积,单位为毫升(mL)； As1 L-羟脯氨酸标准溶液的色谱峰