ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3090—2017 化学农药 浮萍生长抑制试验准则 Chemical pesticide-Guideline for Lemna sp. growth inhibition test 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T3090—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准技术内容等效采用经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.221《浮萍生长抑制 试验》。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部农药检定所。 本标准主要起草人：周欣欣、张燕、刘学、翟唯刚、宗照飞、马凌、郝身伟。 I NY/T3090—2017 化学农药 浮萍生长抑制试验准则 1范围 本标准规定了浮萍生长抑制试验的试验原理、材料与条件、方法、质量控制、试验报告等基本要求。 本标准适用于为化学农药登记而进行的浮萍生长抑制试验，其他类型的农药可参照使用。 本标准不适用于易挥发和难溶解的化学农药。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文代 2. 1 生物量biomass 一个生物种群中活体材料的 本标准中，生物量指标包括浮 体数量、叶面积、干重或 鲜重。 2. 2 TA S 供试物 test substanc 试验中需要测试的物 后 A 2. 3 供试生物 根据试验目 的，用于测试供试物的一种或多种生物受体 2. 4 变色 chloro sis 浮萍叶片组织 只颜色改变 如变黄 2. 5 无性繁殖体 clone 通过无性繁殖 2. 6 无性繁殖群 互相连着的母体和后代叶 千状体（通常 ）的集合体或是整 2. 7 半效应浓度 medianeffectiveconcentration 在生长抑制试验中，使供试生物生物量增长或者生长率比对照下降50%时的供试物浓度，用EC50 表示。在本标准中，指在一定暴露期内，通过浮萍生物量增长的抑制百分率计算而得到的半效应浓度用 E,Cso表示，通过浮萍生长率的抑制百分率计算而得的半效应浓度用E,Cso表示。 注：单位为毫克有效成分每升(mga.i./L)。 2. 8 叶状体frond 浮萍植株的单个“叶状结构”，是最小单位，即个体，有繁殖能力。 2. 9 突起gibbosity 1 NY/T3090—2017 浮萍叶片的凸起或小包。 2. 10 生长growth 试验期间浮萍测量变量如叶状体数量、叶面积、干重或鲜重的增加过程。 2. 11 平均特定生长率averagespecificgrowthrate 试验期间浮萍生物量的对数增长率，用μ表示，单位为百分率（%）。 2. 12 测量变量measurementvariables 任何类型的可被测量的变量。本标准中指叶状体数量、叶面积、鲜重或干重等。 2. 13 单一培育monoculture 个植物种的培养。 2. 14 坏死necrosis 死亡（即发白或水浸状）叶片组织。 2. 15 产量yield 试验期间浮萍叶状体数量、叶面积、干重或鲜重的变化，即一定试验周期内（如7d)最终测量值与初 始测量值之差。 2. 16 响应变量responsevariable 用于估计毒性的变量。本标准中指平均特定生长率和产量。 2. 17 静态试验法statictest 试验期间不更换试验药液。 2. 18 半静态试验法 semi-statictest 试验期间每隔一定时间（如24h)更换一次药液，以保持试验药液的浓度不低于初始添加浓度的一 定百分比水平。 2. 19 流水式试验法flow-throughtest 试验期间药液连续更新。 2. 20 试验培养基testmedium 人工配制的生长介质，供试品通常溶于试验培养基中。 3试验概述 将供试物按等比配制一系列不同浓度的试验药液，然后将不同浓度试验药液与试验培养基混合，接 人浮萍，连续培养7d后，测定试验用浮萍叶状体数量、叶面积、干重或鲜重，求出半效应浓度E,Cso和 E,Cso（7d)值以及95%置信限，以评价受试物对浮萍可能产生的影响。 2 NY/T3090—2017 4试验方法 4.1材料和条件 4.1.1供试生物 本标准的供试生物可使用圆瘤浮萍（Lemnagibba）、小浮萍（Lemnaminor）、紫背浮萍（Spirodela polyrrhiza），具体描述参见附录A。 试验用浮萍可实验室培养或田间采集获得，如果从田间采集，采集地点应未受各种明显污染，并应 在试验开始前将采集到的植株在试验用培养基中培养至少8周；如果从其他实验室培养获得，也应同样 条件下培养至少3周。试验用的植物、种和无性繁殖体的来源均应被详细描述和记录。 4.1.2供试物 4.1.2.1农药制剂或原药 对难溶于水的农,可B量对浮萍影响小的有机溶剂、乳化剂或分散剂 助溶，用量不应超过0. mL( Le RD 4.1.2.2供试物信 a) 化学结构式 b）纯度； c）水溶性 d）水中和光 中的稳定 e)pKa f)Kow g）蒸汽压 h) 生物降 i）定量 4.1.3参比 为检验实 的饮 口 靠性检验。本 标准推荐使用 物顶 氯苯酚（3,5dichlorophenol)对浮料 2次）。 4.1.4主要仪器 R a）结晶皿 U b）人工气候 高压灭菌锅 d) 洁净工作台； e) 酸度计； f）温湿度记录仪； g）照度计。 干净，在使用前进行消毒杀菌，且避免化学污染物混人试验药液和培养基。 4.1.5试验培养基 推荐选择SIS培养基用于小浮萍和紫背浮萍的培养和试验；选择20XAAP生长培养基用于圆瘤 浮萍的培养和试验；也可使用Steinberg培养基培养小浮萍。培养基配方参见附录B。 4.1.6培养和试验条件 用连续的暖或冷白荧光灯提供培养光源，光照/黑暗时间比为16h：8h，在叶与光源同样距离的点 测定光合作用辐射（400nm～700nm)时，光强度在65001x～10000lx范围内。培养和试验环境温度应 控制在(24士2)℃。试验期间对照培养基的pH升高不超过1.5个单位。 3 NY/T3090—2017 4.2试验操作 4.2.1供试生物的培养 无菌操作条件下将试验用浮萍接种到装有经消毒的试验培养基的培养血中，在4.1.6的条件下培 养。为免受如绿藻和原生动物等其他生物的污染，应进行单一物种培养。有被绿藻或其他生物污染的 明显迹象时，可对浮萍叶面进行表面消毒，然后转移到新的培养基中。 4.2.2方法的选择 根据农药的特性选择静态法、半静态法或流水式法进行试验。选择半静态法时，应选择一定的时间 间隔（如试验的第3d、第5d)更换试验药液；当使用静态或半静态法时，应确保试验期间试验药液中供 试物浓度不低于初始浓度的80%。如果在试验期间试验药液中供试物浓度发生超过20%的偏离，则应 检测试验药液中供试物的实际浓度并以此计算结果，或使用流水式法进行试验，以稳定试验药液中供试 物浓度。 4.2.3预试验 按正式试验的环境条件进行预试验，设3个～5个剂量组来确定正式试验的浓度范围。 4.2.4正式试验 在预试验确定的浓度范围内以一定比例间距（公比应控制在3.2倍以内)设置不少于5个浓度组， 4.2.5限度试验 当预试验结果表明供试物在100mga.i./L浓度或最大溶解度时没有毒性效应，可直接进行限度 试验。限度试验时，对照组和处理组至少设置6个重复，且对浓度组和对照组进行差异显著性分析（如t 检验）。 4.2.6染毒 在无菌条件下，用经消毒的不锈钢叉或接菌环将有2片～4片可见叶的无性繁殖群从接种培养皿 状体数和无性繁殖群数相同。 试验容器在培养箱中应随机摆放，以降低光强和温度影响导致的空间差异。 如果预先的稳定性试验表明供试物浓度在试验期间（7d)不能保持稳定（即测定浓度低于初始浓度 的80%），推荐采用半静态试验系统，即应选择一定的时间间隔（如试验的第3d、第5d)更换试验药液， 以保持试验体系中恒定浓度。应根据供试物的水中稳定性决定更换新液的频率，极不稳定或挥发物质 要求更高更换频率或采用流水式试验系统。 4.2.7观测与记录 试验开始时，详细记录各处理组及对照组中浮萍突起和清晰可见的叶状体数量及颜色，观测频率自 试验开始每3d观察1次（即7d试验期内至少观察2次）。记录的基本信息包括植株发育的改变，如叶 状体大小及形态、坏死、变色或突起等征兆、无性繁殖群破裂、丧失浮力、根长及形态，试验用培养基的显 著特征（如不溶物的存在、浮萍的生长）也应记录。 总叶状体面积、干重和鲜重可按下列方法测定： a) 总叶状体面积：所有无性繁殖群的总叶状体面积可通过影像分析进行测定。用摄影机将试验 容器和植株的剪影拍下来（即将容器放人光盒中），把产生的影像数字化。通过与已知面积的 平面形状校准，总叶状体面积可以测定。须小心排除试验容器边缘造成的干扰。或将试验容 器和植株影印下来，切下无性繁殖群的剪影，用叶片面积分析仪或方格纸测定面积。也可采用 无性繁殖群剪影面积和单位面积的贴纸重量比等技术进行测量。 b）干重：每个试验容器中的所有无性繁殖群收集起来后，用蒸馏水或去离子水清洗，吸干多余的 水后在60℃烘干至恒定重量，所有根的碎片应包括在内，干重精度应精确到0.1mg。 4 NY/T3090—2017 c）鲜重：所有无性繁殖群转移到事先称重的聚苯乙烯（或其他惰性材料）圆底管（圆底上有1mm 小孔），然后将管放人离心机中离心（室温下3000r/m