ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3089—2017 化学农药 青一代繁殖延长试验 准则 Chemical pesticideGuideline for medaka extended one generation reproduction test 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T3089—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准主要技术内容等效采用了经济合作与发展组织（OECD)化学品测试导则No.240《青一代 繁殖延长试验》（英文版2015），仅做了结构和编辑性修改。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部农药检定所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所。 本标准主要起草人：吴长兴、曲、陈丽萍、陈朗、苍涛、李贤宾、蔡磊明。 I NY/T3089—2017 化学农药 青一代繁殖延长试验准则 1范围 本标准规定了化学农药对青一代繁殖延长试验的材料、条件、质量控制、试验报告的基本要求。 本标准适用于测试和评价化学农药对青一代繁殖延长试验，其他类型的农药可参照使用。 本标准不适用于易挥发和难溶解的化学农药 2规范性引用文件 PUBL 凡是注日期的用文 件，仅注日期的版本适用于本文 文单)适用午本 件。凡是不注日期的 用文 ，其温新版本（包括所 件 GB/T21806 化 品 Q GB/T3127 化学农 全评价试验准则 第 OECD TG 229 鱼类豆 期紧殖试 Fish Term R eproduct S 3术语和定义 下列术语和 义适 本文件 A 3. 1 最低可观察 est observed effect concentration 在一定暴露 组租比对受 产生显 表示。 CEN 注：单位为毫克 有效成 3. 2 无可观察效应 no-observed effect concentration 在一定暴露期内 对 影响P 的最 物浓度，用NOEC表 示，即仅低于LOE 供成物 注：单位为毫克有效成分（ 3. 3 X%效应浓度 effectconcentrationfor oerfect -定的试验期内，与对照组相比，引起 爱试鱼出现某种效应的供试物浓度，用ECx表示。 注：单位为毫克有效成分每升（mg 3. 4 稀释液、储备液和试验溶液 稀释液和储备液是指流水式试验系统中所用的试验用水和高浓度供试物溶液；试验溶液指用于暴 露的各浓度处理的供试物溶液。 4试验概述 根据供试物对鱼的毒性与代谢行为设置5组试验浓度。将性成熟的日本青（Oryziaslatipes)F。 代雌鱼和雄鱼配对暴露于试验溶液3周。在第4周的第1d或第1d～第2d收集鱼卵作为F代继续暴 NY/T3089—2017 发育端点评估，12周～14周评估繁殖力。评估繁殖力3周后开始培育F²代，F2代全部孵化后结束 试验。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1供试生物 5.1.1.1供试生物及饲养 供试生物为日本青（Oryziaslatipes）。饲养光照周期光暗比为16h：8h。日本青的饲养方式 不设定特定要求。 5.1.1.2受试鱼的驯化 5.1.1.2.1受试鱼应来自同一个实验室的相同品系，在与试验环境相似的条件下驯化至少2周，该驯 养期不能作为预暴露期。受试鱼宜来自本实验室。试验至少需要雌雄42对鱼来保证足够的重复，当有 溶剂对照时要用54对。应检测F。代繁殖对的性别基因，验证其是XX一XY基因型，避免使用XX基因 型的假雄鱼。 5.1.1.2.248h的稳定期后，记录驯养鱼群的死亡数，并按照以下要求操作： a）试验前7d内鱼群的死亡率<5%，该批鱼可用于试验； b）试验前7d内鱼群的死亡率在5%～10%之间，再驯化7d达到14d的驯化期；第二个7d内死 亡率≥5%，整批鱼不应用于试验，第二个7d内死亡率<5%，该批鱼可用于试验； c）试验前7d内鱼群的死亡率≥10%，整批鱼不应用于试验。 5.1.1.2.3驯化期和暴露期间不应对受试鱼进行疾病防治，有疾病症状的鱼不可用于试验。驯化前的 饲养期间，应记录疾病的预防、治疗过程及结果。 5.1.1.3受试鱼的选用 选择同一批驯化的、鱼龄（自受精卵）≥12周、性别差异明显且遗传稳定的成年鱼。试验前1周，应 确认试验成鱼具有活跃的繁殖能力。所有用于试验的鱼按性别分类，同性别受试鱼的体重应该保持在 算数平均值的土20%范围内。在试验前应抽样测量受试鱼的平均体重。雌鱼体重应≥300mg，雄鱼体 重应≥250mg。 5.1.1.4饲喂 可以喂食虫龄为24h的卤虫（Artemiaspp.）幼虫，品种不限。也可补充喂食市售饲料。市售饲料 应定期检测污染物含量。应避免使用具有内分泌干扰活性的食物（如植物雌激素）。未吃掉的食物及排 泄物按规定清除，如用虹吸法小心清洁每个容器。容器边缘和底部每周清洗1次～2次，可用刮刀刮 除。各时期食物饲喂量参见附录A。 5.1.2供试物 供试物应使用农药纯品或原药。不推荐使用助溶剂，如果使用需说明使用理由。难溶于水的原药 可用少量对鱼类毒性小的有机溶剂、乳化剂或分散剂等助溶。已知可用的助溶剂包括：二甲基亚砜、三 甘醇、甲醇、丙酮、乙醇等。当供试物使用有机溶剂助溶时，应尽可能降低助溶剂浓度，试验药液中助溶 剂的浓度不应超过100μL（mg)/L，并应以助溶剂最大浓度设置溶剂对照组。 5.1.3主要仪器设备 溶解氧测量仪； pH测量仪； 水硬度计； 酸碱度测定仪； 恒温室或恒温箱，自动温度监测仪； 2 NY/T3089—2017 一电子天平。 5.1.4试验用水 试验用水应适合受试鱼长期存活和生长。试验期间应保持水质恒定，定期取样分析，避免水质变化 影响试验生物和试验结果。测定包括重金属（如Cu、Pb、Zn、Hg、Cd、Ni）)、主要阴离子（如Cl-、SO）和 阳离子（如Ca²+、Mg²+、Na+、K+）、其他农药、总有机碳和固体悬浮物的含量等。如确定试验用水的水 质相对稳定，可每6个月测定一次。试验用水的化学特性见附录B。 5.2试验操作 5.2.1暴露方法的选择 -般不限定暴露系统的设计和材料。根据本试验的原理，可用玻璃、不锈钢或其他化学惰性材料构 建流水式试验系统，试验系统应在试验前未受到污染。 的流速，试验期间还需检查溶液更换周期。同时，应根据供试物的化学稳定性和水质，确定试验溶液的 更新频率，每天更新5倍～16倍试验体积，或流速大于20mL/min。 5.2.2试验设计 5.2.2.1试验浓度 应设置不少于5个供试物浓度处理组，另设空白对照组。如果使用助溶剂，需同时设置空白对照组 和溶剂对照组。试验浓度范围可参考现有的资料信息，如相似物的信息、已有的鱼类毒性试验结果，按 照GB/T31270.12、GB/T21806和OECDTG229等鱼类毒性试验方法完成的试验数据，也可进行繁 殖期的预试验，以确定正式试验浓度范围。进行预试验时，试验条件（水质、试验系统、生物负荷量）应尽 可能与正式试验一致。通过预试验还可了解助溶剂的适用性。最高试验浓度不应超过供试物的水中溶 解度、10mg/L或96h-LCso的1/10；最低试验浓度应为最高试验浓度的1/100~1/10，各浓度间级差 应<3.2。设置的5个试验浓度应确保能够计算剂量-效应关系，并获得LOEC和NOEC。 5.2.2.2试验重复 每试验浓度至少6个重复，对照组12个重复，当设溶剂对照组时，其重复数应与空白对照组相同。 试验重复设置方法参见附录C。F，代繁殖期间所有处理重复数加倍。每重复为一对雌雄配对鱼。 5.2.3试验准备 试验前，将符合试验要求的配对鱼分别移入试验容器中，每试验容器为一个重复 5.2.4试验暴露 5.2.4.1暴露环境 试验环境条件和参数见附录D。试验结束时对照组的端点指标应达到附录E中所列指标要求， 试验期间，各处理组和空白对照组至少测定一个试验容器中的溶解氧、pH和温度。每天测定水 温，其他指标至少每周测定一次。 5.2.4.2暴露时间 F。代鱼暴露3周，在第4周，建立F代并将F。代安乐死并移出，记录其体重和体长。F1代暴露15 周，F2代暴露2周至孵化。试验时间共19周。试验暴露时间参见附录F。 5.2.4.3各暴露阶段 5.2.4.3.1第1周~第3周(F。) F。代鱼暴露3周，使发育中的配子体和性腺组织暴露于供试物。每试验容器只培养一对繁殖对 （XX基因型雌鱼与XY基因型雄鱼各一尾）。从试验第1d开始，连续21d收集鱼卵，统计产卵数及受 精率。 5.2.4.3.2第4周(F。和F,) 3 NY/T3089—2017 第22d收集当天的受精卵（胚胎），当胚胎不足时可收集两天内的胚胎。将1d或2d内收集到各繁 殖对的受精卵混合，并系统分酸至孵化器，每个孵化器20粒受精卵，孵化器示例参见附录G。每天检查 并记录受精卵的死亡数，并及时从孵化器中移除死卵。死亡胚胎由于蛋白质的凝结和沉淀，由半透明变 为白色。 当某处理需使用第2d收集的卵时，则所有处理组（包括对照组）也应按同一操作进行。当两天收 集的胚胎数还不足时，可将胚胎数减少至每孵化器15个，再低时，需减少重复数，以确保每个孵化器有 15个胚胎。第24d,对F。代繁殖对实施安乐死并记录其体重和体长。如有需要，F。代繁殖对可延长饲 养观察1d～2d,以便重新获得Fi代胚胎。 5.2.4.3.3第5周～第6周(F,) 孵化开始前1d～2d，停止或减少对受精