ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3085—2017 化学农药 意大利蜜蜂幼虫毒性试验准则 Chemicalpesticide-Guideline onhoneybee(Apis mellifera L.)larval toxicity test 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T3085—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.237(2013年）《蜜蜂（意大利蜜蜂)幼虫 毒性试验，一次暴露》（英文版）、指导文件草案（2014年2月25日）《蜜蜂（意大利蜜蜂）幼虫毒性试验， 重复暴露》（英文版）技术内容相同。 本标准在验证各项技术指标的基础上，做了结构和编辑性修改： 为与现有标准一致，将标准名称修改为《化学农药意大利蜜蜂幼虫毒性试验准则》； 正文中增加术语和定义； 将移植格修改为聚苯乙烯或聚丙烯材质的育王台基； 蜜蜂幼虫室内饲养时，删除在48孔培养板中添加15%甘油杀菌液的建议； 孵化箱或孵化盒内相对湿度修订为50%～70%； 删除试验准则中对物质进行化学分析的建议； 计量单位改为我国法定计量单位。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任， 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：浙江省农业科学院农产品质量标准研究所。 本标准主要起草人：苍涛、陈丽萍、吴长兴、赵学平、吴迟、吴声敢、汤涛、徐明飞、蔡磊明、王强、胡秀 卿、俞瑞鲜。 NY/T3085—2017 化学农药 意大利蜜蜂幼虫毒性试验准则 1范围 本标准规定了意大利蜜蜂幼虫毒性试验的术语和定义、试验方法、数据处理、质量控制、试验报告的 基本要求。 本标准适用于测试和评价化学农药对蜜蜂幼虫毒性试验，其他类型的农药可参照使用。 本标准不适用于易挥发和难溶解的化学农药。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T31270.10—2014化学农药环境安全评价试验准则第10部分：蜜蜂急性毒性试验 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 校正死亡率correctedmortality 经空白对照组自然死亡率加以校正的药剂处理组的死亡率。 3. 2 半致死剂量medianlethaldose 一定试验观察时间内，引起50%供试生物死亡时的供试物剂量，用LD50表示。 注：单位为微克有效成分每幼虫（μuga.i./幼虫）。 3. 3 半效应剂量medianeffectivedose 一定试验观察时间内，引起50%供试生物出现某种效应的供试物剂量，用ED5表示。 注：单位为微克有效成分每幼虫（μuga.i./幼虫）。 3. 4 半效应浓度medianeffectiveconcentration -定试验观察时间内，引起50%供试生物出现某种效应的供试物浓度，用ECso表示。 注：单位为毫克有效成分每千克饲料（mga.i./kg饲料）。 3. 5 无可见效应剂量 no-observedeffectdose 在一定时间内，与对照组相比，对供试生物无显著影响（P>0.05)的供试物最高剂量，用NOED表示。 注：单位为微克有效成分每幼虫（μga.i./幼虫）。 3. 6 无可见效应浓度no-observedeffectconcentration 在一定时间内，与对照组相比，对供试生物无显著影响（P>0.O5）的供试物最高浓度，用NOEC表示 注：单位为毫克有效成分每千克饲料（mga.i./kg饲料）。 3. 7 蜜蜂幼虫larvaofhoneybee 1 NY/T3085—2017 蜜蜂卵孵化后至变态化蛹前的虫态。 3. 8 预蛹prepupa 蜜蜂老熟幼虫停止取食至蜕皮成蛹之前的发育阶段。 3. 9 蛹pupa 蜜蜂老熟幼虫停止取食后至成虫羽化前的一个发育阶段。化蛹时，幼虫结构解体，成虫结构形成， 初次出现翅。 3. 10 羽化 emergence 蜜蜂由蛹经过蜕皮，变化为成蜂的过程 3. 11 鲜蜂王浆 fresh royal jelly ARD 在试验开始前 4试验概述 RES 4.1方法概述 S 蜜蜂幼虫 毒性 试验包 盗蜂幼虫急 电慢性毒性 供试物性质及试验 目的选择相应 进行品 4.2蜜蜂幼 试验 在蜜蜂黛 白铃蜜蜂幼 期从虫 群电移政 至育 培养板，人工 标准化饲养至 验结束 正式物 性投喂给幼 虫。观察并计 24h 他异常行为和列 ，求出 后72h的半 CEI 致死剂量(LD ?950 4.3蜜蜂幼虫慢 在蜜蜂繁殖其 8 胞培养板，人工 标准化饲养至羽 喂含有 应剂量 物的人工饲料。 第4d至第8d每天 羊记录蛹及未化 幼虫的死亡数，第2 率、羽化率，通过对 供试物处理组和空白对照 组的羽化率 进行 确定无可见效 度或无可见效应剂量 （NOEC或NOED）。如可能计算半效应浓） 95%置信限。 5试验方法 5.1材料和条件 5.1.1供试生物 5.1.1.1供试生物及来源 供试生物为意大利蜜蜂（ApismelliferaL.)幼虫，来自饲料充足、健康、无疾病和寄生虫、4周内未 接受抗生素和抗螨虫药物治疗的蜂群。 5.1.1.2蜜蜂幼虫的获取 试验用蜜蜂幼虫应来自3个不同的蜂群，分别作为各剂量处理的不同重复组。在蜜蜂繁殖期，试验 边缘。翌日检查新卵产出情况，并从产卵控制器中移出蜂王，避免在试验蜂脾上再次产卵，蜂王的隔离 2 NY/T3085—2017 时间最多不超过30h。移虫前将移虫针、人工育王台基浸没在70%酒精（体积比)或其他消毒液中至少 30min进行消毒后，晾干待用。产卵3d后用移虫针将1日龄的幼虫随机转移至育王台基中（移虫环境 温度不低于20℃），每个台基放入1头幼虫，在试验条件下，用人工饲料饲养。 5.1.2人工饲料 5.1.2.1人工饲料的组成 人工饲料由酵母提取物、葡萄糖、果糖、无菌水和鲜蜂王浆配制而成。不同日龄蜜蜂幼虫使用的3 种不同饲料配方如下（均为重量比）： 饲料A：酵母提取物：葡萄糖：果糖：无菌水：鲜蜂王浆=1：6：6：37：50； 饲料B：酵母提取物：葡萄糖：果糖：无菌水：鲜蜂王浆一 15:7.5:7.5:33.5:50; 饲料C：酵母提取物：葡萄糖：果糖：无菌水：鲜蜂王浆=2：9：9：30：50。 5.1.2.2人工饲料的配制与储存 PUBI 试验开始前，首先按 量比1：1混匀，放置 C条件下储 件下冷冻储存，试验 取出鲜 5.1.2.3含供试 物饲 料的配制 用水或有机 溶剂 将供试物 勿溶解并稀释至不同浓度将不同衣度供 别与 与人工饲料混合制 成含供试物饲 S SE 5.1.3蜜蜂幼虫白 的室内饲 将育王台 别放 孔中可海 棉用于垫高 见附录B 王台基底部·所有 虫灯天 定日 (±0.5h)投 喂一次（除第 不得高于35℃：第1d 20μL饲料 A后，将细胞 板转移 不需要投喂第3d每头幼虫投喂 B,第4d、第 5d、第6d每 虫分另 见附录C 时避免饲料 掩没幼虫，应 ，月 沿着台基壁将 生吸管或移液 器吸除。第8 幼虫或 纸的化村 了选用48孔细 胞培养板)中 浆饲喂器的孵化盒或孵化箱中 武验结 参见附录D)。 5.1.4供试物 供试物应使用 用溶剂助格， 荐溶剂为丙酮。 5.1.5主要仪器设备 蜂王产卵控制器 移虫针； 洁净工作台； 聚苯乙烯或聚丙烯材质的育王 48孔细胞培养板； 化蛹板； 含有糖水饲喂器的孵化盒或孵化箱； 移液器； 温度、湿度控制设施； 温湿度记录仪； 电子天平 5.1.6试验条件 试验在温度（34.5士0.5)℃，黑暗的条件下进行。在幼虫或预蛹转至化蛹板之前，保持相对湿度 3 NY/T3085—2017 （95土5)%（推荐幼虫饲养孔板置于底部盛有硫酸钾饱和溶液的密闭容器内）；幼虫或预蛹转至化蛹板之 后至化蛹板放入孵化盒或孵化箱之前，保持相对湿度（80土5）%（推荐幼虫饲养孔板置于底部盛有氯化 钠饱和溶液的密闭容器内），化蛹板放人孵化盒或孵化箱之后至试验结束，保持相对湿度50%～70%。 整个试验过程中允许温度出现一定偏差，但不低于23℃或高于40℃，每24h内出现偏差次数不超 过一次，且不超过15min。 5.2试验操作 5.2.1蜜蜂幼虫急性毒性试验 5.2.1.1暴露途径 蜜蜂幼虫达到4日龄（即附录C第4d)当天，每头幼虫投喂30μL含有相应剂量供试物的饲料C。 染毒后24h、48h每头幼虫分别投喂40μL、50μL不含供试物溶液的饲料C。每次投喂饲料前，如育王 台基中有剩余饲料，则用一次性吸管或移液器吸除并记录剩余量。如果使用水溶解供试物，则投喂的含 供试物饲料中供试物溶液的体积应<10%。如果使用有机溶剂溶解，其使用量应尽可能降到最低，并且 投喂的含供试物饲料中供试物溶液的体积应5%，实际添加供试物溶液的量需根据供试物的溶解度、 有机溶剂的毒性综合考虑而定。 5.2.1.2预备试验 在进行正式试验之前按正式试验的条件，以较大间距设置系列剂量组，通过预试验明确正式试验所 需的合适剂量范围。 5.2.1.3正式试验 根据预备试验确定的剂量范围，按一定比例间距（几何级差应<3倍）设置不少于5个剂量组。同 时设空白对照组，当使用助溶剂时，增加设置溶剂对照组，对照组及各处理组均设3个重复，每个重复至 少12头幼虫。染毒后观察蜜蜂幼虫的中毒症状和其他异常行为