ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3080—2017 大白菜抗黑腐病鉴定技术规程 Rule for evaluation of chinese cabbage resistance to black rot 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 3080—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出。 本标准由全国蔬菜标准化技术委员会（SAC/TC467)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。 本标准主要起草人：杨宇红、谢丙炎、冯兰香、杨翠荣、振川、陈国华、凌键。 I NY/T3080—2017 大白菜抗黑腐病鉴定技术规程 1范围 本标准规定了大白菜抗黑腐病（Xanthomonascampestrispv.campestris）的鉴定方法和评价方法。 本标准适用于大白菜（BrassicarapaL.ssp.pekinensis)抗黑腐病的室内鉴定及抗性评价。 2规范性引用文件 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单）适用 月于本文件 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方 3术语和定义 NY/T1857 h 界定的以 利定 用 3. 1 S 大白菜黑腐病 由野油菜黄 ammel)DowsonJ引 起的细菌性病害 注：病害表现 牛叶缘形成学形或长条形黄褐色病斑，病斑周围伴有黄色褪 部分外 枯、脱落，植株茎部，根部的维管束变黑，严重时叶片皇现出以“牵柄”或 边瘫 催“等症状为主的大白 菜病害 干燥条售 4试剂与材料 C 除非另有说明 听用虚 T6682 三级水 4.1酵母葡萄米 糖碳 4.1.1液体培养 20 并溶化后，酸碱度调 至pH7.0，于121° 压菌 高 4.1.2固体培养基：在液 体培养基中加人 4.2葡萄糖蛋白陈培养基 4.2.1液体培养基：葡萄糖 蛋白陈10g，水解酪蛋白1g，水100 nL,搅拌均匀并溶化后，酸碱度 调至pH7.0，于121℃高压灭菌30min 4.2.2固体培养基：在液体培养基中加入15g -18g琼脂粉。 4.3育苗基质 将草炭、蛭石和菜田土按2：1：1（体积比）的比例混合均匀，于134℃高温蒸汽灭菌30min。 5仪器设备 5.1恒温摇床 回旋频率范围：40r/min~300r/min；温控范围：5℃～60℃。 5.2恒温培养箱 温度范围：0℃~50℃；温度波动：士0.5℃。 NY/T 3080—2017 5.3低温冰柜 箱内温度：-15℃～一25℃。 5.4灭菌锅 温度范围：0℃~135℃；灭菌时间：4min~120min；最高工作压力：0.22MPa~0.25MPa。 5.5超净工作台 洁净等级：100级@≥0.5um；平均风速：0.25m/s~0.6m/s。 5.6分光光度计 波长范围：200nm~1000nm；波长误差：士1nm；透射比准确度：土0.5%（T）。 6黑腐病菌接种体制备 6.1病原菌分离、保存 6.1.1病原菌分离 取大白菜黑腐病发病植株叶片病健交界组织，用常规稀释分离法或平板划线分离法分离黑腐病病原菌。 分离物鉴定参照附录A，确认为野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonascampestrispv.campestris) 后，采用稀释涂布平板法进行分离物纯化，经柯赫氏（Koch'sPostulates)法则验证后，保存备用。 6.1.2病原菌保存 将黑腐病菌培养于葡萄糖蛋白陈或YDC液体培养基中，在（28土1)℃、150r/min下振荡培养24h 后取培养物于等体积的40%甘油中混合均匀，分装在冻存管内置（一20土1)℃冰柜中保存；或将在葡萄 糖蛋白陈或YDC培养基上培养的新鲜黑腐病菌从斜面上洗下或挑下，放入灭菌水中，在室温下保存，6 个月重新活化转存1次。 6.2生理小种鉴定 对用于抗病性鉴定接种的病原菌进行生理小种的鉴定，鉴定方法见附录B。 6.3接种体繁殖和制备 根据育种目的，有针对性地选择优势小种作为接种病原菌。将保存在灭菌水中的菌种摇匀，移至葡 萄糖蛋白陈或YDC液体培养基中，在（28土1)℃、150r/min下振荡培养24h，加适量无菌水调整至接种 浓度，制成接种液。 7室内抗性鉴定 7.1鉴定对照材料 设北京小杂56或北京大牛心等易感病品种为感病对照品种。 7.2鉴定材料育苗 鉴定材料种子在50℃热水中处理10min后，置于（25土1)℃恒温培养箱中催芽。待种子发芽后播 于装有育苗基质的塑料育苗钵内，每钵播种1粒种子。在温室里育苗，室内温度白天为22℃～25℃，夜 晚为17℃～20℃。选择生长健壮、一致的幼苗用于抗病性鉴定。 7.3接种 7.3.1接种时期 大白菜生育期4叶期～5叶期。 7.3.2接种浓度 约108CFU/mL(OD600=0.2)。 7.3.3接种方法 接种前将植株移到鉴定室内，浇透水并盖膜于15℃～20℃保湿一夜，相对湿度大于90%，使叶缘吐 2 NY/T3080—2017 露，第2天早晨喷雾接种，以叶片布满菌液但无液滴滴落为度。鉴定材料随机或顺序排列，每份鉴定材 料重复3次，每一重复10株苗。 7.4接种后管理 接种后保湿24h，相对湿度大于90%，接种期间鉴定室温度控制在25℃～28℃范围内，每天光照 12h~14h。 8 病情调查 8.1调查时间 接种后12d～15d调查病情，根据此期间感病的对照品种病级扩展到感病病级的时间做适当调整。 8. 2 2病情级别划分 幼苗病情分级及其对应的症状描述见表1。 表1大白菜抗黑腐病室内鉴定病情级别的划分 病情级别 症状描述 0 接种叶叶片上无任何症状 1 接种叶水孔处有黑色枯死点，无扩展 3 接种叶病斑从水孔向外扩展，小于叶面积5%以下 5 接种叶病斑从水孔向外扩展，占叶面积5.1%～25% 7 接种叶病斑从水孔向外扩展，占叶面积25.1%～50% 9 接种叶病斑从水孔向外扩展，占叶面积50.1%以上 8.3调查方法 调查每份鉴定材料接种叶片发病情况，根据病害症状描述，逐份材料进行调查，记载接种叶片病情 级别,计算出病情指数(DI)。 病情指数(DI)按式(1)计算。 (sXn) DI = X 100 (1) NXS 式中： DI 病情指数； s 各病情级别的代表数值； n 各病情级别的病叶数，单位为叶； N 调查总叶数，单位为叶； S ——最高病情级别的代表数值。 计算结果取3次重复平均值。 9 抗病性评价 9.1抗病性评价标准 依据鉴定材料的病情指数（DI)平均值确定其抗性水平，划分标准见表2。 表2大白菜对黑腐病抗性评价标准 病情指数(DI) 抗性评价 0<D≤11.1 高抗(HR) 11.2≤D≤33.3 抗病(R) 33.4D55.5 耐病(T) 55.6≤DI≤77.7 感病(S) 77.8≤D100 高感(HS) 3 NY/T3080—2017 9. 2 鉴定有效性判别 当感病对照材料达到其相应感病程度（DI≥55.6)，该批次抗黑腐病鉴定结果视为有效 10 鉴定材料处理 鉴定完毕后将大白菜发病植株、残体集中进行无害化处理，用于鉴定的育苗基质高温灭菌。 11 鉴定记载 大白菜抗黑腐病鉴定结果记录表格参见附录C NY/T3080—2017 附录A （资料性附录） 大白菜黑腐病病原菌 A.1学名 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种[Xanthomonascampestris pv.campestris(Pammel)Dowson]。属 于细菌域（DomainBacteria），普罗斯特细菌门（Proteobacteria），普罗斯特细菌纲（Gammaproteobacte ria），黄单胞杆菌目（Xanthomonadales），黄单胞杆菌科（Xanthomonadaceae），黄单胞杆菌属（Xan thomonas)。 A.2形态描述 菌体杆状，大小为（0.7~3.0）μm×（0.4～0.5）μm，单极生单鞭毛，无芽孢，有荚膜，菌体单生或链 生，革兰氏反应阴性，好气性。在牛肉汁琼脂培养基上菌落近圆形，初呈淡黄色，后变为蜡黄色，边缘完 整，略凸起，薄或平滑，具光泽，老龄菌落边缘呈放线状。 A. 3 生理生化特征 最适生长温度25℃～30℃，致死温度51℃，最适湿度为80%~100%，最适pH6.4，尿酶阴性，过氧 化氢酶阳性，能液化明胶，能在蛋白陈中产生硫化氢，不还原硝酸盐，耐氯化钠2.0%～5.0%，G十C含 量(64士1)%。该菌还能产生一种独特的不溶于水的黄色素，能产生胞外多糖又称黄原胶，还能分泌淀 粉酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、磷脂酶等。