ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3073—2017 家畜魏氏梭菌病诊断技术 Diagnostic techniques for clostridium welchi disease of livestock 2017-06-12 发布 2017-10-01 实施 中华人民共和国农业部 、发布 NY/T 3073—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：山东农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、青岛康大集团公司。 本标准主要起草人：柴同杰、李卫华、郭梦娇、蔡玉梅、韦良孟、王海荣、马连营、李明勇、刘曼。 NY/T 3073—2017 家畜魏氏梭菌病诊断技术 1范围 本标准规定了家畜魏氏梭菌病的诊断技术。 本标准适用于家畜魏氏梭菌病的临床诊断、实验室诊断、检验检疫、监测及流行病学调查等。 2 临床诊断 2. 1牛魏氏梭菌病 2.1.1牛魏氏梭菌病主要由D型、E型产气荚膜梭菌感染引起。 2.1.2不同年龄、不同品种的牛(黄牛、奶牛、水牛等)均可感染发病，且四季均可发生。发病黄牛、特牛 多为体格强壮、骠情较好者,奶牛多为高产牛。病程长短不一，短则数分钟至数小时,长则3d～4d或更 长；有的呈跳跃式发生。 2.1.3临床表现为突然不安、呼吸困难。最急性型病例无任何前驱症状,倒地死亡,有的在使役中或使 役后突然死亡。 2.1.4急性型病牛体温升高或正常，呼吸急促，精神沉郁或狂躁不安，全身肌肉震颤、抽搐，行走不稳， 口流白沫，最后倒地而死。 2.1.5亚急性型呈阵发性不安，发作时两耳竖直，两眼圆睁，表现出高度的精神紧张,后转为安静，如此 周期性反复发作，最终死亡， 2.1.6急性和亚急性病牛有的发生腹泻,肛门排出含有多量黏液、色呈酱红色并带有血腥异臭的粪便， 有的排粪呈喷射状水样。 2.1.7病理变化以全身实质器官出血和小肠出血为主要特征，肠道气。 2.2羊魏氏梭菌病 2.2.1羊魏氏梭菌病主要由D型、B型产气荚膜梭菌感染引起。 2.2.2不同品种（小尾寒羊、黑山羊、奶山羊、绵羊、卡拉库尔羊等）、不同年龄的羊均可感染发病，一年 四季均可发生，但以春秋多发,尤其是天气骤变、气温突然下降时。 2.2.3一般都是急性发作,病羊磨牙流涎,排带黏液粪便,有的为黏液性黑色混血稀粪。死后不久，腹 部迅速膨大，口鼻常有白色或带血泡沫流出。 2.2.4病理变化为整个肠道黏膜充血,特别是小肠充血、出血、黏膜脱落；胃黏膜脱落,有出血性炎症; 肾变软(肾糜烂),稍加触压即溃烂,水冲洗后，肾表面呈绒毛状。 2. 3 猪魏氏梭菌病 2.3.1猪魏氏梭菌病主要由A型、C型产气荚膜梭菌感染引起，称猪梭菌性肠炎、猪传染性坏死性肠 炎、仔猪红痢等。 2.3.2该病病程短,死亡快,死亡率高，一旦流行会导致大批仔猪死亡，但年龄稍大的猪造成死亡的 少见。 2.3.3主要临床症状为腹泻、粪便呈红褐色,粪便有腥臭味。 2.3.4病理变化为肠黏膜及黏膜下层广泛出血，肠壁呈深红色、部分肠段气。肠壁变得薄而透明，空 肠与回肠充满胶冻状液体。盲肠内有稀粪且有恶臭气体，胃黏膜脱落。 2.4家兔魏氏梭菌病 1 NY/T 3073—2017 2.4.1家兔魏氏梭菌病主要由A型产气荚膜梭菌感染引起， 2.4.2一年四季均可发生，但春季和由秋向冬季转变过程中、气温骤降时多发。各种年龄均可发病,断 奶幼兔发病率与死亡率较高。病兔在水泻的当天或次日即死亡，多为急性死亡。 2.4.3以急性腹泻,排黑色水样或带血胶冻样粪便。肛门周围、后肢及尾部被毛被稀粪污染。抓起病 兔摇晃躯体有泼水音。 2.4.4病理变化为胃底黏膜脱落,并有大小不等的黑色溃疡,肠黏膜呈弥漫性充血或出血，小肠充有气 体，肠壁变薄，盲肠和结肠内充满气体和黑绿色稀粪便,有腐败臭味，膀胱积有茶色尿液 2.5结果判定 根据动物表现出的上述临床症状和病理变化,可判定为疑似魏氏梭菌病。 3产气英膜梭菌的分离、鉴定 3.1仪器、材料准备 3.1.1仪器 光学显微镜、超净工作台高 压灭菌锅和厌氧培养箱。 REs 3. 1. 2 培养基和试剂 胰脉一亚硫酸盐— 丝氨酸琼脂基础培养基（配制方法见附录A中的 、血琼脂平板（配制方 色阁 3.2涂片、镜检 A 检刀观 采取清洁玻片在病死畜禽肠道病变部位黏膜进行组织触片，革兰氏染色、镜 见察到视野中革兰 氏染色反应阳性 般是 工 3.3样品采集 无菌采集病死 mL 灭菌营养肉汤培养 （适宜比例的I H2CO43° 3.4细菌分离培养 接种环取 3环 5环接禾 种在胰肠 Z硫酸盐一环丝氨酸琼脂基础(TSC)上, 厌氧培养24h。 观察菌落形态,将黑色可疑菌落再接种到血琼脂平板上(血琼脂基础+5%公绵片 [%葡萄糖），43℃ 、双溶血环,平板从培养箱取出后,有异 厌氧培养24 h分离培养 臭味,菌落颜色由灰褐变 绿色。 3.5产气荚膜梭菌纯培养 挑取疑似菌落,涂片镜检。再对疑似菌落纯分离培养,得到纯分离株 3.6生化鉴定 对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖、木糖、甘露醇、水杨苷、吲哚试验、H2S试验、MR、还原性硝酸 盐试验、明胶液化进行试验。把分离株菌液加人生化反应发酵管中,厌氧培养24h，观察生化试验结果。 3.7牛乳培养基进行暴烈发酵试验 该菌能使牛奶培养基“暴烈发酵”。 3.8结果判定 TSC培养基上可疑菌落为黑(玄)色；血平板上可疑菌落双溶血环,平板从培养箱取出后,菌落颜色 由灰褐变为绿色。生化反应是葡萄糖十、麦芽糖十、蔗糖十、果糖一、乳糖十、木糖一、甘露醇一、水杨 苷一、吲哚试验一、H2S试验十、MR十、还原性硝酸盐试验十、明胶液化十，以及牛奶培养基“暴烈发酵” 的分离株可判定为产气荚膜梭菌。 2 NY/T 3073—2017 4产气英膜梭菌毒素基因的PCR检测 4.1材料准备 4.1.1仪器 厌氧培养箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、数显恒温水浴锅、振荡器、离心机、高压灭 菌锅。 4.1.2培养基和试剂 血琼脂平板、增菌培养基、Taq酶、DNA模板、dNTPs、双蒸水。 4.2引物 根据产气荚膜梭菌4种主要毒素基因序列和国内外公开发表的引物序列合成通用引物（见表1）。 表 1 引物序列 基因,bp 上游引物（5'-3'） 下游引物（5'-3'） α(alpha)cpa(325) GCTAATGTTACTGCCGTTGA CCTCTGATACATCGTGTAAG β(beta)cpb(196) GCGAATATGCTGAATCATCTA GCAGGAACATTAGTATATCTTC e(epsilon)etx(656) GCGGTGATATCCATCTATTC CCACTTACTTGTCCTACTAAC t(iota)iap(446) ACTACTCTCAGACAAGACAG CTTTCCTTCTATTACTATACG 4.3DNA模板的制备 4.3.1增菌 将第3章分离鉴定的产气荚膜梭菌接种于营养肉汤培养基中,43℃厌氧培养12h。 4.3.2模板制备 法见附录B中的B.1)混匀作为模板。 4. 4 PCR 反应体系(25 μL) 4.4.1PCR反应体系 10 X Taq buffer(含 Mg2+) 2.5 μL dNTPs 2.5 μL 上游和下游引物(10pmol/μL) 各1μL 模板 2 μL 无菌双蒸水 15.75 μL Taq DNA 聚合酶 0. 25 μL 4. 4.2对照 标准菌株的菌体做阳性对照,用大肠杆菌标准菌株的菌体做阴性对照,用无菌双蒸水做空白对照。 4.5 PCR反应 94℃变性5min，然后30个循环，分别为：94℃变性30s;53℃退火30s；72℃延伸1min。最后72℃ 延伸10min,4℃保存。 4.6电泳 用TAE(配制方法见B.2)制备1%琼脂糖凝胶,加样6μL～8μL,在电压80V～100V、电流40mA 下进行电泳30min~40min。 4.7结果判定 用凝胶成像仪观察扩增条带，在阴性对照和空白对照泳道无条带，阳性对照泳道出现α325bp、β196 3 NY/T 3073—2017 bp、s656bp、t446bp的清晰条带的条件下,根据阳性条带大小判断样品阳性或者阴性（参见附录C)。 5产气英膜梭菌毒素型的ELISA鉴定 5.1仪器、材料准备 5.1.1仪器 酶标仪、恒温水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台、厌氧培养箱、恒温箱、96孔高吸附性酶标板、洗瓶或 者洗板机。 5.1.2培养基和试剂 血琼脂平板、增菌培养基、产毒培养基(配制方法见 A.4)、抗 C-酶标抗体、抗 D-酶标抗体、包被液 (配制方法见附录D中的D.1)、PBS(配制方法见 D.2)、PBST(配制方法见 D.3)、封闭液(配制方法见 D.4)、酶标抗体稀释液(配制方法见 D.5) 5.2毒素的制取 5.2.1检测样品毒素 5.2.1.1复苏 将第3章分 荚膜梭菌接禾 凉脂 43℃厌氧培 5.2.1.2产生毒素 在增菌培养基中增菌 12 h。每个样品取 1 mL 肉汤培养物加人到 9 ml 振荡培养4 h。 培养物产生 产气荚膜梭菌毒素 AR A 5.2.1.3毒素制备 器微滤膜过滤，一20℃ 培养物用 4℃ g，15 min离心。上清液借助于孔径为0.22 μm的注射 的低温冰箱保存 工 5.2.2对照 C 3180)和 D型(Weybridge CTC 8504 ）分别作 参考菌种C型CWeybridge 为阴性对照和阳 E