ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3063—2016 马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程 Code of practice for evaluation of potato resistance to late blight in greenhouse 2016-12-23 发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 3063—2016 前 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则编写。 本标准由农业部种子管理局提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院蔬菜花卉研究所 本标准主要起草人：杨宇红、谢丙炎、冯兰香、振川、凌键、陈国华。 I NY/T 3063—2016 马铃薯抗晚疫病室内鉴定技术规程 1范围 本标准规定了马铃薯抗晚疫病（lateblight)离体叶片和盆栽鉴定方法与评价标准。 本标准适用于马铃薯（Solanumtubero sumL.）品种和材料对晚疫病抗性的室内鉴定及评价。 2 术语和定义 PUBLI 下列术语和定义适用于本文 2. 1 RD 马铃薯晚疫病 由致病疫霉[ Ph ytophthora 、叶柄、茎和块茎引起的一 种流行性卵菌病害 (病害诊断 见附 3试剂与材料 s 3. 115% 甲亚(DMSO)溶液 在 85 mL 灭菌水 加入15ml 甲亚砜，混匀后贮存于4℃冰箱中 3.2抗生 素 母液R 称取 素、0. 2 g 利福平、1 g制霉菌素分别溶于少量水 ，利福平需先溶于少 量二甲亚砜中 搅拌至 上滤器过滤后，贮存于 4℃冰箱中 备 3 3.3 培养基 3. 3. 1 黑麦培养基) 黑麦粒60 g 音粉 g、水1000mL. 6h，用捣碎机捣碎 后经3～4层纱 文浸泡水和滤液加水定容至1000mL,加人蔗糖 热并搅拌至琼脂完全 溶化后，于(121 min 3.3.2选择性黑麦培养基 当100mL灭菌黑麦培养基冷却至约 种抗生素母液 50℃日 加 mle 使培养基中氨苄青霉 素、利福平和制霉菌素的终浓度分别为 mL /mL。 3.3.3黑麦粒培养基 在50mL离心管中加人3.3g黑麦粒和20m 水，浸泡 2h后，于（121±1)℃高压灭菌15min。 注意灭菌时不要将管盖完全拧紧，灭菌后再紧管盖备用。 3.4对照材料 3.5育苗基质 将草炭、蛭石和菜田土按体积2：1：1混合均匀，于（134土1)℃湿热灭菌1h。或直接购买商品化 蔬菜育苗基质。 3.6其他用品 培养皿、托盘、离心管、烧杯、量筒、锥形瓶、纱布、滤纸、酒精灯、细菌过滤器、小型手持喷雾器、育苗 钵等。 NY/T 3063--2016 4仪器设备和设施 4.1显微镜 放大倍率：40倍～1000倍。 4. 2 2恒温培养箱 温度范围：0℃～50℃，温度波动不大于1℃。 4.3高压灭菌锅 灭菌温度范围：104℃～135℃，灭菌时间范围：4min～120min，最高工作压力：0.25MPa～0.22 MPa. 4.4移液器 量程体积：2μL～20μL，系统误差：土1.2%，随机误差：土0.6% 4.5电子天平 称量范围：0g~1000g，分度值：0.01g。 4.6捣碎机 额定转速：10000r/min12000r/min，处理量：500mL，工作方法：断续。 4.7超净工作台 洁净等级：100级@≥0.5μm，菌落数：≤0.5个/（皿·h）（Φ90mm培养平皿），平均风速： 0. 25 m/ s~0. 6 m/ s。 4.8人工接种鉴定室 具备人工调节温度、湿度及光照的条件，使人工接种后具备良好的发病环境 5鉴定方法 5.1离体叶片法 5.1.1材料育苗 将供鉴定材料及感病对照的种薯置于15℃～20℃下催芽。待薯芽长1cm～1.5cm时，将种薯切成 每块只带1个健康芽眼的薯块，芽眼朝下播于装有育苗基质的育苗钵内，每钵播种1块，置于日光温室 里，温度保持在18℃～25℃，常规水肥管理，自然光照。待幼苗长到7片～10片复叶时，选择生长一致、 健壮的幼苗用于抗病性鉴定 5.1.2接种体制备 见附录B。 5.1.3接种 从植株顶部计起，取第3、4、5片展开叶，背面朝上置于双层湿润灭菌滤纸上，在每个小叶叶背主叶 脉的一侧用微量移液器滴加10μL浓度为8×103个孢子囊/mL的孢子囊悬浮液。每份材料设3个重 复，每重复不少于6片复叶。 5.1.4接种后管理 接种后将容器用保鲜膜封好，置于18℃～20℃光照培养箱内，在每日光照16h，黑暗8h，相对湿度 100%条件下培养。 5. 1.5 病情调查 5.1.5.1调查方法 接种后5d～6d，以复叶的每片小叶为调查单位，测定病斑面积及观察有无孢子囊和霉层，根据表1 中的病害症状描述，逐份材料进行调查，记载接种叶片病情级别。 2 NY/T 3063—2016 5.1.5.2病情级别划分 马铃薯抗晚疫病离体叶片法鉴定的病情级别划分见表1。 表1马铃薯抗晚疫病离体叶片法鉴定的病情级别划分 病情级别 症状描述 0 接种叶叶片上无症状 1 仅在叶片上出现针尖大小的枯死斑 2 病斑直径小于0.5cm，周围无褪绿晕圈 3 病斑直径0.5cm～1.0cm,病斑水浸状且周围有退绿晕圈，病斑表面可见到白色菌丝体 4 病斑继续扩大，占叶片总面积的1/2,病斑周围有明显的褪绿圈，并有明显的白色霉层 5 病斑占叶片面积的2/3以上，病斑表面有大量的白色霉状物，并出现组织坏死 5.1.5.3病情指数计算 病情指数(DI)按式(1)计算。 (s Xn) DI X 100 NXS (1) 式中： DI 病情指数； s 各病情级别数值； n 各病情级别的病叶(株)数； N 调查的总叶(株)数； s 病情级别的最高数值。 5.1.6鉴定材料处理 鉴定完毕后，将马铃薯发病植株、残体集中进行无害化处理,用于鉴定的育苗基质采用高温灭菌。 5.2盆栽喷雾法 5.2.1材料育苗 同5.1.1。 5.2.2接种 采用喷雾接种法。将在温室内生长1.5个月～2个月的幼苗移到人工接种鉴定室进行喷雾接种， 以叶片布满菌液但无滴落为度。接种液浓度为8X103个孢子囊/mL。鉴定材料随机或顺序排列，每份 鉴定材料设3个重复，每一重复不少于10株苗。 5.2.3接种后管理 接种后在100%相对湿度下保湿2d后，将相对湿度降为70%左右。接种期间温度保持在15℃~ 20℃范围内，每天光照16h，待4d～5d发病后继续盖膜保持100%的相对湿度，24h后进行调查。 5.2.4病情调查 5.2.4.1调查方法 接种后6d～7d调查病情。以植株为单位调查每份鉴定材料接种后植株的发病情况，根据表2病 害症状描述，逐份材料记载接种植株病情级别,按式(1)计算病情指数(DI)。 5.2.4.2病情级别划分 接种植株病情分级及其对应的症状描述见表2。 3 NY/T 3063-—2016 表2 马铃薯抗晚疫病盆栽喷雾法鉴定的病情级别划分 病情级别 症状描述 0 全株叶片无病斑 1 1/5以下叶片上有个别病斑，茎秆无病斑 3 病叶占全株总叶片数的1/4以下，或植株上部茎秆有个别小病斑 5 病叶占全株总叶片数的1/4～1/2，或植株上部茎秆有扩展型病斑 7 病叶占全株总叶片数的1/2以上，或植株中下部茎秆上有较大病斑 9 全株叶片几乎都有病斑，或大部分叶片枯死，甚至茎部枯死 5.2.5 鉴定材料处理 同5.1.6。 P 6 抗病性评价 6. 1 离体叶片法抗病性评价 6.1.1 评价标准 抗性划分标准 见表 马铃薯抗晚疫病离体叶片法鉴定的评价标 DD 高抗 40 抗发 <60 中感 感病 高感 S 6. 1. 2 鉴定有效性 判别 当感病对照材 达到 DL 60），该 批次抗晚疫 定结果 6.1.3抗性判断 C 依据鉴定材料 抗性水平 写出 并附原始记录 （参见附录C)。 6.2盆栽喷雾法抗病性讠 6.2.1评价标准 抗性划分标准见表4。 表 4 马铃薯抗晚疫病盆栽喷雾法鉴定的评价 标准 病害指数(DI) 抗性评价 DI<1 高抗（HR） 1<D≤10 抗病(R) 10<DI≤20 中抗(MR) 20<DI≤30 中感(MS) 30<DI≤40 感病(S) DI>40 高感(HS) 6.2.2 鉴定有效性判别 当感病对照的植株达到其相应感病程度(DI>30)，该批次鉴定结果视为有效。 6.2.3抗性判断 同6.1.3。 4 NY/T 3063—2016 附录A (资料性附录) 马铃薯晚疫病 A.1 症状描述 主要受害部位为叶片、叶柄、茎和块茎，多从植株下 部叶片开始。 叶片染病在叶尖或叶缘出现水渍 为褐色 并在其周围产生一圈白霉，尤 以叶背最明显;茎部或叶柄的病斑为褐色条 之后，病斑上也可产生白色霉层，多 雨条件下整个植株腐！ 上形成大小不等 陷的病斑,病斑组织为浅褐色至 深褐色的坏死 病薯 RESE A.2 病原菌 A.2.1学名 致病疫霉 [Phyto hthora in Jestans (Mont. 属于卵菌纲 tes 霜霉目（Peronos porales) ceae)疫霉属（Phytophthora A. 2. 2 形态描述 晚疫病 麦琼脂培养基或黑麦番茄汁培养基上生长，菌落白 无色、无隔、自由分 枝。孢囊梗由 由菌丝生 出,直立 合轴分枝,顶端 膨大形成 生长，将孢子囊推 向一侧，顶端 再次膨 形成新的孢子囊·使整 抱囊 可的结节状 孢囊梗顶站 端尖细，孢子囊顶 生或侧生 无 色、单胞 卵圆形或近圆形.大小为（2 μum> ～23) 柄,较易脱落 游动孢子 形 中游动片刻后静止， 鞭毛收缩成为 止孢( 见图 橘黄色， 或近球 24 9.1