ICS 65.020.01 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2947-2016 枸杞中甜菜碱含量的测定 高效液相色谱法 Determination of betain in wolfberryHPLC method 2016-10-26 发布 2017-04-01 实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 2947—2016 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部枸杞产品质量监督检验测试中心。 本标准主要起草人：王晓菁、牛艳、吴燕、姜瑞、张锋锋。 I NY/T 2947—2016 枸杞中甜菜碱含量的测定 高效液相色谱法 1范围 本标准规定了枸杞中甜菜碱的测定方法。 本标准适用于枸杞中甜菜碱含量的测定， 本方法检出限为0.001g/100g。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 枸杞样品中甜菜碱组分经甲醇溶液[(CH:OH-H2O)=2.5十7.5]提取后，用混合型阳离子交换 固相萃取柱净化，再用乙睛溶液[y(CH:CN-H2O)=7.5十2.5]定容，最后用配有紫外检测器的高效液 相色谱仪在波长205nm处测定，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量 4试剂与材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的一级水。 4.1氨水：含量为25%~28%，优级纯。 4.2盐酸：含量为36%～38%，优级纯。 4.3甲醇(CH;OH):色谱纯。 4.4乙腈(CH;CN):色谱纯。 4.5盐酸溶液c(HCl)=0.1mol/L:准确吸取9mL盐酸,加适量水并稀释定容至1000mL。 = 4.7甲醇溶液[y(CHOH-HzO)=8.5+1.5]:取85mL甲醇慢慢加人15mL水中。 4.8氨化甲醇溶液Ly(NH3·H²O-CH:OH)=0.5+9.5]:取5mL浓氨水慢慢加人95mL水中。 4.9乙睛溶液Ly(CH;CN-H²O)=7.5十+2.5]:取75mL乙腈慢慢加人25mL水中。 4.10甜菜碱标准品：≥纯度98%。 4.11甜菜碱标准储备液溶液：准确称取甜菜碱标准物质100mg（精确到0.0001g)用乙腈溶液（4.9） 溶解并定容至10.0mL，配制成10.0mg/mL标准储备液，0℃～4℃贮存。 4.12阳离子交换固相萃取小柱：混合型阳离子交换固相萃取柱，基质为聚苯乙烯一二乙烯基苯高聚 物，150mg/6mL，或相当者。 5仪器与设备 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.2分析天平：感量土0.0001g。 5.3离心机：4000r/min。 1 NY/T 2947—2016 5. 4 涡旋混合器。 5. 5 组织捣碎机：12000r/min。 5. 6 均质器：24000r/min 5.7高速万能粉碎机：10000r/min。 5. 8 旋转蒸发仪。 5. 9 微孔滤膜：0.45μm，有机相。 6 试样制备 干样（枸杞）：实验时将一18℃冷冻保存的样品取出 立即用高速万能粉碎机（可加少量液氮）粉碎 （30g样品粉碎时间约为20 ,置于样品瓶中，P89冷东备用 s），置 于样品瓶中，一18℃冷 冻备用。 7 分析步骤 7. 1 提取 称取枸杞干 样1g（精确到0.001 离心管中 mL甲醇溶液 （4.6），涡旋混勺 提取2min，以3500 5min,取出备 7.2净化 RAL 吸取上清液5 人已活化 平衡的混合型阳离 换固相 萃取柱中 商/s 的流速，待 样液进人萃取小柱白 的吸附 层后，依 mL 甲醇溶液（ .7）5mL甲醇进行淋泛 5mL氨化甲醇 将洗脱液旋转浓缩近三 m 乙腈溶液 (4.9)溶解定容 交换固 甲醇 酸溶液 夜活化平衡。 混合型阳离 欠用5ml ENTER 7.3色谱参考条件 色谱柱:亲水 6 mmc 流动相：乙睛 棉度洗 流速：1.0mL/r U nin 柱温：30℃； 波长：205nm； 进样量：10.0uL； 流动相梯度洗脱程序见表 动相梯度汤 时间，min 水，% 乙腈,% 0 5 95 2 10 90 3 30 70 4 50 50 6 50 50 10 5 95 15 5 95 7.4标准曲线的绘制 用乙睛溶液（4.9)将甜菜碱标准贮备液溶液逐级稀释得到浓度为0g/100mL、0.002g/100mL、 2 NY/T 2947—2016 0. 005 g/100 mL、0. 01 g/100 mL、0. 02 g/100 mL、0. 05 g/100mL、0.1 g/100 mL、0. 2g/100 mL的标准 工作液，依次由低到高进样检测，质量浓度X(g/100mL)为横坐标，以相应的峰面积Y为纵坐标进行线 性回归，得到标准曲线回归方程。 7.5测定 取标准工作溶液和样品定容液（7.2)进样测定，以色谱峰保留时间定性，以标样色谱峰峰面积和样 品溶液峰峰面积比较定量。同时做空白实验。 8 结果计算 试样中甜菜碱含量按式(1)计算 (1) 式中: 试样 为克每 克（g 夜中甜菜碱的质量 毫升(g/100mL)； V 式样中 取溶液 积，单位为毫升（ml Vi 式样 的最级定 容体积，单 为毫 m 试林 的质量 单位为克 V2 提 取液分取 又体积,单位为毫升(ml 计算结果 有效数 R 9 色谱图 甜菜碱 枸杞样品中甜莱碱组分谱图见图A.1、图 A.2 10精密度 UL C 在重复性 果的绝对 差值不大 测通值 术平均值的10%， 以大于这2 %情况不超过 5%;在再现性 的 2次独立测试结果 的绝对差值 均值的10%,以大于这2个测 定值的 术平均值的10%情况 不超过5%。 U 3 NY/T 2947—2016 附录A （资料性附录） 甜菜碱标准溶液色谱图和样品色谱图 A.1甜菜碱标准溶液色谱图 见图A.1。 0.050 0.040 E 甜菜碱-7.965 0.030 0.010 0.000 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 min 图A.1 甜菜碱标准溶液色谱图(0.02g/100g) A.2枸杞样品中甜菜碱组分色谱图 见图A.2。 0.12 0.10E 一甜菜碱-7.966 0.08 ≥ 0.06 0.04 0.02 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 min 图 A.2 枸杞样品中甜菜碱组分色谱图 NY/T 2947—2016 附录A （资料性附录） 甜菜碱标准溶液色谱图和样品色谱图 A.1甜菜碱标准溶液色谱图 见图A.1。 0.050 0.040 E 甜菜碱-7.965 0.030 0.010 0.000 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 min 图A.1 甜菜碱标准溶液色谱图(0.02g/100g) A.2枸杞样品中甜菜碱组分色谱图 见图A.2。 0.12 0.10E 一甜菜碱-7.966 0.08 ≥ 0.06 0.04 0.02 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 min 图 A.2 枸杞样品中甜菜碱组分色谱图