ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2898—2016 饲料中串珠镰刀菌素的测定 高效液相色谱法 Determination of moniliformin in feeds- High performance liquid chromatography 2016-05-23 发布 2016-10-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 2898—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：华中农业大学。 本标准主要起草人：齐德生、张妮娅、高思、陈雷。 NY/T 2898—2016 饲料中串珠镰刀菌素的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中串珠镰刀菌素的高效液相色谱测定法。 本标准适用于谷物及其加工副产品、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中串珠镰刀菌素的测定。 本标准的方法检出限为0.003mg/kg，定量限为0.05mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 试样中的串珠镰刀菌素经四丁基硫酸氢铵(TBAHS)水溶液提取、二氯甲烷萃取和强阴离子交换固 相萃取柱净化后，采用反相高效液相色谱-紫外检测器进行测定，并用外标法定量。 4试剂和材料 除特别说明外,所有试剂均为分析纯和符合GB/T6682中规定的二级用水，标准溶液和流动相用 水符合 GB/T 6682中一级用水的规定。 4.1甲醇：色谱级。 4.2 乙腈:色谱级。 4. 3 四丁基硫酸氢铵(TBAHS)。 4.4 二氯甲烷。 4. 5 二水合磷酸二氢钠。 4.6氢氧化钠。 4. 7 提取液:称取 5 g 四丁基硫酸氢铵(4. 3),用水溶解并定容至 1 L,制成 5 g/L 的四丁基硫酸氢铵 溶液。 4.8 试剂 A:称取 40g四丁基硫酸氢铵(4.3),用水溶解并定容至100mL,制成 400g/L的四丁基硫酸 氢铵溶液。 4.9试剂B:称取17.16g二水合磷酸二氢钠（4.5）,用水溶解并定容至100mL,制成1.1mol/L的磷 酸二氢钠溶液。 4.10离子对改性剂试剂A(4.8)和试剂B(4.9)按照体积比1：2混合均匀后即成离子对改性剂。 4.11乙腈-水溶液 A:将乙腈(4.2)和水按照体积比1：1混合均匀备用。 4.12乙腈-水溶液B：将乙腈（4.2)和水按照体积比8：92混合均匀备用。 4.132mol/L氢氧化钠溶液：称取 80g氢氧化钠(4.6),用水溶解并定容至1L。 1 NY/T 2898—2016 4.140.05mol/L磷酸二氢钠溶液：称取7.8g二水合磷酸二氢钠（4.5),用水溶解并定容至1L,pH为 5.0,有效期为1个月。 4.15流动相：取10mL离子对改性剂（4.10）,用乙腈-水溶液B(4.12)稀释至1L，并用氢氧化钠溶液 (4.13)调pH为6.5，经0.22um有机微孔滤膜过滤后备用。 4.16串珠镰刀菌素标准品：串珠镰刀菌素钠盐，纯度≥98%。 4.17串珠镰刀菌素标准储备液：取包装规格为5mg的串珠镰刀菌素标准品，用乙睛-水溶液A（4.11) 溶解定容到50mL容量瓶中，配制成100ug/mL的串珠镰刀菌素标准储备液，转入塑料瓶中一20℃密 封保存，有效期为12个月。 注：其他包装规格的串珠镰刀菌素标准品可按照相应规格调整定容体积，用乙-水溶液A(4.11)配制成100μg/mL 的串珠镰刀菌素标准储备液 4.18串珠镰刀菌素标准工 作液：取10ml L容量瓶中，用磷酸二氢 钠溶液(4.14)稀释至刻度 m的 5. 0 mL、10. 0 mL、20. ml 工作液 00ml 钠溶液（4.14)稀释 至刻度，配制成浓度 分别为 ug ug mL和4.0μg/ mL的标准工作液 转 时保存 ，有效期为3 5仪器和设备 S 5.1 高效液相 仪：配备 紫外检测器或二极管阵列检测器 5.2强阴离子交换 固相萃 取柱（SAX/SPE柱）：规格为 100mg/mL.柱容量1 5.3氮吹仪。 R 5. 4 实验室常规设 备。 试样的采集与 备 按照GB/T 66 由取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取 20195的规定将 饲料样品粉碎，过 中，避光低温保 备压 7分析步骤 7.1提取 人 取4g（精确到0.000 用20.0mL(V) ）提取 两次提取。首先，准 确加入10.0mL提取液（4. 5 min,吸 上清液。再次，准确加入 10.0mL提取液（4.7）重复提取 将两次上清 青液合并混勺，备用。 7.2萃取与浓缩 准确移取3.0mL(V²)上清液(7.1)于离心管中,加人5mL 氯甲烷轻柔摇匀3min后，5000r/ min离心10min，吸出全部二氯甲烷层。再次加入5mL二氯甲烷并重复萃取一次。合并二氯甲烷于玻 璃管中，在40℃下用氮气吹干。向干燥后的玻璃管中加入1mL流动相（4.15），涡旋处理3min，制成浓 缩液。 注：萃取振摇过程中避免用力震荡，氮气吹干应在通风柜中进行。 7.3固相萃取柱净化 用1mL甲醇和1mL流动相连续洗涤固相萃取柱，将浓缩液（7.2）全部转入固相萃取柱中。待所 有浓缩液过柱后，用1mL水清洗固相萃取柱并加压使空气过柱以排出所有清洗液。准确量取1.0mL (V3)磷酸二氢钠溶液(4.14)洗脱固相萃取柱中吸附的串珠镰刀菌素，并加压使所有的洗脱液过柱。用 0.22μm微孔滤膜过滤洗脱液，将滤液储于干净容器中，4℃条件下密封保存备测。 2 NY/T 2898—2016 7. 4 高效液相色谱检测 7. 4. 1 高效液相色谱参考条件 a） 色谱柱：C18反相色谱柱,长150mm,内径4.6mm,粒径5μm; b) 流动相流速：1mL/min； 检测波长：228nm； d)林 柱温：35℃； e）进样量：20μL。 7. 4. 2 定量测定 分别取20μL标准工作液（4.18)和洗脱液（7.3），按照7.4.1 所列色谱参考条件上机测定。以标准 工作液的浓度为横坐标，以相应色谱峰面积为纵坐标 ，绘制标准曲线。 根据洗脱液中串珠镰刀菌素的峰 刀菌素浓度应在标准曲线线性 范围内，超出线性 范围时 JN 现见附录 7. 4. 3 结果计算 串珠镰 刀菌素的含量！ 质量分数 F克（mg 1)计算。 S <V (1) 式中 c 串珠镰刀菌素的浓度，单位为微克每 ug/ /mI Vi 是取液总 体积（7. ），单位为毫升 mL V2 又浓缩的上清液体积（ 单 立为毫升(mL)； Vs 干洗脱白 森酸 氢钠溶液的体积(7.3),单位为毫升(mL m 样的厂 ，单位为克（ 测定结果 用平 均值表示，计算结果 保留 小数 8 重复性 在重复性条件 牛获 得 的两次独立 均值的 ER 的绝对差值不大于该平均 值的15%。 人 NY/T 2898—2016 附录A (资料性附录) 串珠镰刀菌素参考色谱图 0.1μg/mL串珠镰刀菌素标准溶液高效液相色谱图，见图A.1。 mV 检测器A:228nm 7.301 2.53 溶剂中的杂质 2.0 11.267 串珠镰刀菌素 1.0 Es0 0.0 业 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min 图A.1 串珠镰刀菌素标准溶液(0.1ug/mL)高效液相色谱图 4 NY/T 2898—2016 附录A (资料性附录) 串珠镰刀菌素参考色谱图 0.1μg/mL串珠镰刀菌素标准溶液高效液相色谱图，见图A.1。 mV 检测器A:228nm 7.301 2.53 溶剂中的杂质 2.0 11.267 串珠镰刀菌素 1.0 Es0 0.0 业 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min 图A.1 串珠镰刀菌素标准溶液(0.1ug/mL)高效液相色谱图 4