ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1471—2017 代替NY/T1471—2007 牛毛滴虫病诊断技术 Diagnostic techniques for bovine trichomoniasis 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 1471—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替NY/T1471—2007《牛毛滴虫病诊断技术》。与NY/T1471—2007相比，除编辑性修 改外，主要技术变化如下： 病原PCR检查时增加了一对可用PCR引物。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：南京农业大学、中国动物卫生与流行病学中心。 本标准主要起草人：李祥瑞、徐立新、严若峰、宋小凯、郑增忍 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -NY/T 1471—2007。 NY/T 1471—2017 引 言 毛滴虫病是由胎儿三毛滴虫(Tritrichomonas foetus)寄生于牛生殖道引起的疾病。该病呈世界性 分布，,引起牛，尤其是奶牛生殖器官炎症、死胎、流产和不育，可对畜牧业生产造成严重的经济损失。 毛滴虫病被世界动物卫生组织列为通报传染病 该病主要通过自然交配传播，已染病动物的精液 和污染的器械人工授精也可引起传播。 ⅡI NY/T 1471—2017 牛毛滴虫病诊断技术 1范围 本标准规定了牛毛滴虫病的病原显微镜检查技术和聚合酶链反应(PCR)扩增虫体DNA的检测 方法。 本标准适用于牛毛滴虫病的诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法 GB 19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB:hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵。 DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。 dNTP:deoxynucleoside triphosphate,三磷酸脱氧核苷酸 PBS:phosphate buffer solution,磷酸盐缓冲液。 PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链反应。 Taq 酶:Taq DNA polymerase,Taq DNA 聚合酶。 4生物安全措施 进行牛毛滴虫病实验室检测时，如显微镜检查、DNA提取等，按照GB19489的规定执行。 5临床诊断 5. 1 临床症状 5.1.1公牛 公牛很少或没有临床症状发生。若有症状，主要包括黏液性包皮炎，包皮肿胀，并分泌出大量脓性 物质；包皮黏膜上出现粟粒大的红色结节,有痛感，不愿交配。 5.1.2母牛 母牛出现阴道损伤，卡他性炎症，阴道红肿；黏膜出现粟粒大或更大的小结节，排出黏液性分泌物； 宫颈和子宫内膜出现炎症；随后发生不规则的发情，子宫脱垂、子宫积脓和早期(1周～16周)流产。 5.2结果判定 根据牛交配、人工授精或母牛的生殖系统检查史，公牛具有5.1.1临床表现、母牛具有5.1.2临床 表现时,可判定为疑似牛毛滴虫病。 6实验室诊断 6.1样品的采集与运输 1 NY/T 1471—2017 6.1.1样品的采集 6.1.1.1母牛 选择发情后1d2d的母牛,用水将母牛外生殖器洗涤干净。然后,采用下列任何一种方法采样： a 取市场上出售的常规型号的注射器，如50mL、100mL的注射器，将30mL～40mL的30℃～ 35℃灭菌生理盐水急速注人阴道，以洗涤子宫和阴道壁。收集洗涤液于离心管中， 1500r/min～2000r/min离心5min后，取沉淀物作为待检样品。 b）取一长30 cm、直径0.9cm,并在离一端9cm处弯成150°角的消毒玻璃管,注人1mL～2mL 的30℃～35℃灭菌生理盐水，收集母牛子宫颈黏液作为待检样品。 6.1.1.2公牛 首先将公牛外生殖器洗涤干净，吸取5mL～10mL的30℃～35℃灭菌生理盐水注人包皮腔内。然 后,以手压紧包皮口,使液体在腔内滞留 3minP5niB再将洗涤液收集于离心管中,以1500 r/min～ 2000r/min离心5min后,取沉淀物伦为待检样品 6.1.1.3精液 取人工采集或融化的冷冻精液1ml 6.1.1.4其他 产仔牛、流 等可取胎盘液;流产胎牛可取胎儿第4 胃的内容物;发 宫积脓排出物， 000（min离心5mlin后，取沉淀物作为待检样品。 S 以1500r/min 注：不同情况下毛滴虫的数量有所不同。在流产胎儿、流产后3d～8d内和新近感染 产宫里均含有大量虫体。 在感染后12 d～20d的母牛阴道黏液内也含有大量虫体。在 个发情周期内毛滴虫的数量也有所不同，发情后 3 d～7d 内毛滴虫的数量最多。这些时段采集的样品可直接进行镜检。 R 6.1.2样品的运输和储存 C 样品采集后 应立即镜检或置于无菌密闭容器内37℃ 24 h内送实验室检查。 若用于 PCR检测，可 置于无菌密闭容器内低温冷冻保存。 C 6.2主要仪器、材料和试剂 除特别说明以 规定的灭菌双蒸水或超纯水。 显微镜、载玻 染色 6H7.2的PBS （见 A.2)、CTAB抽提液(见 A ）、CTAB/NaCI 溶液（见 A.4）、高速离心机、涡旋振荡器、热启动 Taq 聚合酶、1×PCR 反应缓伸液、400 μmol/LdNTPs.1.5 mmol/LMgCl²、电泳仪/粉碎器、匀浆器、研钵和 研杆、捣碎机、抗有机溶剂的试管或烧杯。 6.3病原显微镜检查 6.3.1压滴标本检查法 将采集的待检样品1滴置于载玻片上，盖上盖玻片，在100倍或以上倍率的显微镜下，视野放暗，迅 速进行检查。可重复进行2片～3片 6.3.2染色标本检查法 将采集的待检样品少量置于载玻片一端，立即推制成均匀的薄膜。在室温下干燥，后用甲醇固定 2min。将固定的抹片浸入足量的姬姆萨染色稀释液的染色皿中,染色0.5h～1h,取出水洗，吸干或烘 干后镜检。 6.3.3结果判定 在显微镜下观察，胎儿三毛滴虫的形态特征参见附录B。两种方法只要有一种方法观察到胎儿三 毛滴虫即判为病原镜检阳性，未观察到胎儿三毛滴虫判为病原镜检阴性。 6.4病原PCR检查 6.4.1 PCR 引物 2 NY/T 1471—2017 可采用引物TFR1/TFR2和TFR3/TFR4中任何一对用于胎儿三毛滴虫的核酸检测，引物序列和 扩增产物的大小见表1。 表1J 用于牛毛滴虫病PCR检测的引物 引物 目的 序列(5'-3') 产物 TFR1 正向引物 TGCTTCAGTTCAGCGGGTCTTCC 372 bp TFR2 反向引物 CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGG TFR3 正向引物 CGGGTCTTCCTATATGAGA CAGAACC 347 bp TFR4 反向引物 CCTGCCGTTGGATCAGTTTCGTTAA 6.4.2病原 DNA的制备 以下两种方法任选其 0mL，在涡旋振荡器上混 匀,取出 1 mL 移人1. 5 mL微量离心 100 min,弃上清，在沉淀物中加人 2 mL TE(10 mmol/ 转 5ml 离心管 10% SDS 和 50 μL 的 5 mg/mL的蛋白酶K,再 2 h. 加人300μL的5 mol/ L I NaCI充分混匀;再加人240μL CTAB/NaCl溶 液，混 C温育1 15 min。加人等 体积的酚/ 氯仿，混匀，10000 min离心4 吸出上 青移至另 新管中，加人等体 积的酚/氯仿混匀，10 000r/min离心5min 吸出上 清移至另 新管中，大 加入 0.6体积异丙 醇,轻摇混匀,15 000 r/min4℃离心10 min 15 min! 弃上清，沉淀】 DNA mL70%乙醇 10000r/ /min离心2min。弃上清，重复洗涤 次，干燥2 min。加人 08 的TE缓冲 立即使用或一20℃冰箱冻存备用 液重悬 b）试剂盒 的制备 制备的DNA -30 的TE缓冲液重悬 6.4.3 PCR反应 C 6. 4.3. 1 PCR 反应模板 采用6.4. 备的DNA 为模板DNA 未进行过 殖系统检查的青 生生 性对照 #集的样品中加人 胎儿三毛滴虫后按6. 别备的DNA；空 白对照为无菌去离子水 T 6. 4. 3. 2 PCR 反应体 反应体为25μL,依次加入:引 物 TFR1和TFR2或引物TFR3和 R4 μmol/L;1XPCR反 应缓冲液;400 μmol/L dNTPs;1. 5 mmol/LMgClz;2 J热启动 Taq聚合酶,5 μL待检样品DNA溶液， 用双蒸水补足体积至 25 μL 6.4.3.3PCR扩增条件 95℃预热10min。94℃变性30s,67℃ 正伸90 s,35个循环，然后72℃延伸15min。 6.4.3.4PCR产物电泳 取PCR产物5μL,在1%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统中观察结果(参见附录 C)。 6.4.3.5质控标准 采用TFR1/TFR2引物扩增，阳性对照样品出现大小372bp扩增条带，阴性对照和空白对照无任 何扩增条带，说明试验成立。 采用TFR3/TFR4引物扩增，阳性对照样品出现大小347bp扩增条带，阴性对照和空白对照无任 何扩增条