ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1466—2018 代替NY/T1466—2007 动物棘球呦病诊断技术 Diagnostic techniques for animal echinococcosis 2018-03-15 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 1466—2018 目 次 前言 引言 范围· 规范性引用文件 3临床诊断 3.1流行病学 3.2临床症状 3.3棘球蜘病病理组织学诊断 3.3.1剖检 3.3.2病理组织学变化 3.3.2.1肝细粒棘球蜘病病理变化 3.3.2.2肺细粒棘球蜘病病理变化 3.4结果判定 4实验室诊断 4.1间接红细胞凝集试验(IHA) 4.1.1材料 4.1.1.1 待检血样的采集 4.1.1.2 血清分离与保存 4.1.1.3 对照阳性血清 4.1.1.4 对照阴性血清 4.1.1.5 IHA诊断液制备 4.1.1.6 微量反应板 4.1.2 操作方法 4.1.2.1 稀释被检血清 4.1.2.2 加诊断液(抗原) 4.1.2.3 设对照· 4.1.2.4 血凝反应 4.1.3 判定 4.1.3.1 判定标准 4.1.3.2 结果判定 4.2酶联免疫吸附试验(ELISA) 4.2.1仪器 4.2.2耗材 4.2.3试剂 4.2.3.1 血样的采集、血清分离与保存 4.2.3.2 抗原， 4.2.3.3 对照阳性血清 4.2.3.4 对照阴性血清 NY/T 1466—2018 4.2.3.5 抗免疫球蛋白-酶结合物 4.2.3.6 试验溶液 4.2.4 操作方法· 4.2.4.1 抗原包被 4.2.4.2 洗涤· 4.2.4.3 封闭， 4.2.4.4 加待检血清 4.2.4.5 加抗免疫球蛋白-酶结合物 4.2.4.6 显色· 4.2.4.7 终止反应 4.2.5判定 4.2.5.1 计算. 4.2.5.2 结果判定 4.3家畜与野生动物棘球坳感染PCR诊断. 4.3.1 试验材料 4.3.1.1 仪器 4.3.1.2 试剂. 4.3.2操作程序 4.3.2.1 棘球蜘可疑包囊病灶采集 4.3.2.2 待检样本的处理 4.3.2.3 基因组 DNA 的提取 4.3.2.4 基因组DNA含量测定· 4.3.3PCR操作方法 4.3.3.1 引物选用 4.3.3.2 反应体系 4.3.3.3 PCR反应产物的观察 4.3.3.4 结果判定 5诊断结果判定 附录A(资料性附录) 三种棘球虫病原学与流行病学特征比较 附录B(资料性附录) 棘球包囊及囊液中原头坳的形态学观察 附录C(规范性附录) IHA诊断液配制方法 附录D(规范性附录) 棘球囊液醋酸盐纯化抗原制备方法 11 附录E(规范性附录) 抗免疫球蛋白-酶结合物的制备方法· 12 附录F(规范性附录) ELISA溶液配制 附录G(规范性附录) 电泳相关试剂的配制 16 附录H(资料性附录) 基因组 DNA提取方法 17 附录I（资料性附录） 棘球终虫PCR检测方法相关信息 18 附录J(规范性附录) 三种棘球终虫特异性多重PCR扩增产物电泳图 19 IⅡI NY/T 1466—2018 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T1466—2007《动物棘球蜘病诊断技术》。与NY/T1466—2007相比，除编辑性 修改外主要技术变化如下： 修改IHA诊断方法中“参考阳性血清”为“对照阳性血清”，“用棘球坳囊液抗原免疫羊和牛制 备”为“经病原学确诊的牛、羊棘球蜘病自然感染病例的混合血清制备”（见4.1.1.3)； 调整了IHA诊断方法中被检血清的阴、阳性判定标准（见4.1.3.2； 增加了棘球坳囊液醋酸盐纯化抗原制备的方法（见附录D）。 增加了临床症状和病理学组织诊断的内容（见3.2和3.3）。 增加了三个棘球虫虫种（细粒棘球终虫、多房棘球虫和石渠棘球虫）的PCR诊断技术 （见4.3）； 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所。 本标准主要起草人：贾万忠、闫鸿斌、李立、娄忠子、付宝权、殷宏、李有全。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T1466—2007。 Ⅲ NY/T 1466—2018 引言 棘球坳病(Echinococcosis），又名包虫病（Hydatid disease/Hydatidosis），是由棘球属（Echinococ- 世界动物卫生组织(OIE)定为必须通报的动物疫病之一,被中国列为二类动物疫病。 （E.multilocularis）、石渠棘球虫（E.shiquicus），相应的幼虫分别为细粒棘球坳、多房棘球坳和石渠 棘球坳，主要特征参见附录A。 棘球蝴病流行于中国西部及东北广大农牧区，其中青海、新疆、宁夏、甘肃、四川、内蒙古和西藏等7 省（自治区）最为严重。 棘球虫需要两个宿主（即中间宿主和终末宿主）才能完成生活史。对于中间宿主，羊是细粒棘球 坳的最易感动物，牛次之；田鼠是多房棘球常见、易感的动物；高原鼠兔是石渠棘球坳常见、易感的动 物。对于终末宿主，犬、狐狸、狼是细粒棘球絲虫感染常见动物，狐狸和犬是多房棘球虫感染常见动 物，藏狐是石渠棘球虫感染常见动物 寄生部位：幼虫，即细粒棘球蜘多寄生于肝,其次为肺；多房棘球坳多寄生于肝脏；石渠棘球坳多寄 生于肺。成虫，即棘球绛虫均寄生于犬科动物的小肠。 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及4.3.3.1引物选用相关的专利的使用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人姓名：娄忠子，贾方忠，自鸿斌，李宏民，李立，范彦雷，倪兴维 地址：甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 IV NY/T 1466—2018 动物棘球呦病诊断技术 1范围 本标准规定了动物棘球坳病感染的临床诊断、实验室诊断和诊断结果判定。 本标准适用于家畜（牛、羊）细粒棘球哟病血清抗体的检测和剖检及病理组织学诊断，家畜与野生动 物（田鼠、高原鼠兔等）细粒棘球呦病、多房棘球病和石渠棘球哟病可疑包囊或病灶样品的PCR诊断， 家畜与野生动物棘球坳病流行病学调查和检测 2规范性引用文件 RD 下列文件对于本 件的 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期白 本（包括） 的修改 单 GB/T 6682 试验方法 NY/T 541 医诊断样 采集 人 3临床诊断 S 3. 1 流行病学 在流行区 间宿 与终床宿 良、狐狸等)吞 食过带有棘王 器是该病传播流行的主 3.2 临床症状 细粒棘珠 奇生 时 寸出理 现疼痛。寄生 于羊肺部时咳 嗽 细粒棘球 消瘦 和按压检查时 有疼痛感，叩诊 重时，呼吸困难和 的咳嗽;听诊时在不 JTER 同部位有局限性 油音 3. 3 棘球蜘病病理组 3.3.1剖检 细粒棘球蜘寄生于绵 羊和耗牛肝脏时肝肿大 色暗条 红寄生 肺时， 显肿大，周边有肉样实 质性病变。寄生部位有大 不等的灰白色 透明的包囊组织：其中突出 脏器表面的包囊呈乳白色、 平整光滑、不透明。见附录B中图B.1。 多房棘球坳多寄生于田鼠，也可寄生于高原鼠兔；石渠棘球 主要寄生于高原鼠兔，也可寄生于田 鼠，目前，未发现寄生于家畜或人。多房棘球坳寄生于青海田鼠和石渠棘球坳寄生于高原鼠兔的剖检图 见图B.2。 较大的包囊切开后，囊液略带黄色、透明，包囊组织与肝、肺交界处可见乳白色包囊壁，无血管结构， 囊壁分两层，其中外侧一层为角质层，内侧一层为生发层。抽取囊液，沉淀物在光学显微镜下检测，发现 沉淀物中存在原头节。见图B.3。 3.3.2病理组织学变化 3.3.2.1肝细粒棘球蜘病病理变化 显微镜下观察，羊肝细粒棘球蜘包囊外层（即外囊)呈典型的特殊肉芽肿病变，由纤维组织和上皮样 细胞构成，结构致密、无血管。内囊呈乳白色、半透明、表面平滑、有光泽的球形包囊；棘球蜘囊壁分两 NY/T 1466—2018 层，外层是不含细胞结构的角质层，内层是生发层（胚层）。在生发层的内面长出很多细小颗粒状的育囊 （原头呦）及雏囊（子囊），故名细粒棘球呦。角质层由生发层细胞的分泌物形成，板层样结构，富含糖原， PAS(periodic acid Schiff,过碘酸希夫)染色反应阳性,即红染，这是棘球蜘病的示病性特征。 包囊周围肝细胞受压迫而发生萎缩；肝间质结缔组织大量增生，将肝小叶分割，形成假小叶，小胆管 显著增生。肝细胞呈明显的水泡变性，细胞肿胀。有些部位的肝细胞消失，取而代之的是一些均质、淡 红染的浆液、纤维素性渗出物,渗出物中可见大量以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润、充血、出血。 3.3.2.2肺细粒棘球蜘病病理变化 棘球坳包囊内充满囊液，有时有原头。包囊的囊壁内侧为均质红染的板层结构，板层结构外侧为 普通肉芽组织；有的包囊囊壁由上皮样细胞和成纤维细胞构成，未见均质红染的板层结构（PAS阴性）。 部分肺间质增生、伴随大量淋巴细胞浸润，发生炎症反应；包囊外侧肺泡腔受压迫呈裂隙状；肺泡壁高度 增生，小血管充血，有大量淋巴细胞与嗜酸性粒细胞浸润。外囊壁包含肺组织和小气管。 3.4结果判定 3.4.1绵羊、山羊、耗牛等出现