ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1248.6—2016 玉米抗病虫性鉴定技术规范 第6部分：腐霉茎腐病 Technical specification on evaluation of maize resistance to pests- Part 6 : Pythium stalk rot 2016-10-26 发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 1248.6—2016 前 言 NY/T1248《玉米抗病虫性鉴定技术规范》拟分为13个部分： 第1部分：大斑病； 第2部分：小斑病； 第3部分：丝黑穗病； 第4部分：矮花叶病； 第5部分：玉米； 第6部分：腐霉茎腐病； 第7部分：镰孢茎腐病； 第8部分：镰孢穗腐病； 第9部分：纹枯病； 第10部分：弯孢叶斑病； 第11部分：灰斑病； 第12部分：瘤黑粉病； 第13部分：粗缩病。 本部分为NY/T1248的第6部分 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由农业部种子管理局提出并归口。 本部分起草单位：中国农业科学院作物科学研究所、全国农业技术推广服务中心、河北省农林科学 院植物保护研究所、四川省农业科学院植物保护研究所、吉林省农业科学院植物保护研究所。 本部分主要起草人：王晓鸣、孙世贤、石洁、李晓、晋齐鸣。 I NY/T 1248.6—2016 玉米抗病虫性鉴定技术规范 第6部分：腐霉茎腐病 1范围 本部分规定了玉米抗腐霉茎腐病鉴定技术方法和抗性评价标准。 本部分适用于栽培玉米（Zea mays L.）自交系、杂交种、群体、开放授粉品种以及野生玉米和玉米近 缘种对腐霉茎腐病抗性的田间鉴定和评价。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 土壤接种soil inoculation 将病原菌放置在植株根系附近土壤中的接种方法。 2. 2 腐霉茎腐病pythium stalk rot 由卵菌中的腐霉菌（Pythium spp.）侵染所引起的以玉米植株基部茎节茎髓组织分解为特征的玉米 病害。该病害引起玉米植株茎节内部腐烂、叶片青灰色干枯、果穗下垂、籽粒灌浆不足和根系变黑腐烂 的症状。 3腐霉菌接种体制备 3.1病原菌分离 以常规组织分离法从发病植株茎秆基部节位的发病茎髓组织中分离茎腐病致病腐霉菌。病原菌经 形态学鉴定确认为腐霉菌（Pythium spp.）（参见附录A)后，进行纯化培养和致病性测定。 3.2致病种鉴定 对用作抗病性鉴定接种体的病原菌应进行种的鉴定。鉴定采用形态学和分子鉴定的方法（参见附 录A),确定病原菌的种级地位。 3.3病原菌繁殖 在接种前需要进行病原菌的繁殖。常用方法为将在培养基上培养的病原菌接种于经高压灭菌的玉 米粒上扩大繁殖。培养7d10d后，菌丝布满玉米粒，即可用于接种（参见附录A）。可采用不同地点 来源的多个腐霉菌菌株分别繁殖后混合接种。 4抗病性鉴定圃 4.1鉴定圃设置 鉴定圃应具备良好的自然发病环境，能够进行灌溉。 4. 2 鉴定设计 鉴定材料随机排列或顺序排列，在进行选育品种抗病性鉴定时，每30行鉴定材料设1组已知高抗、 高感对照材料（参见附录B)；在进行种质资源抗病性鉴定时，每50行鉴定材料设1组已知高抗、高感对 照材料。 1 NY/T 1248. 6—2016 4.3种植要求 鉴定材料播种时间与大田生产播种时间相同或适当调整，以使植株发病期能够与适宜的气候条件 (降雨与温度)相遇。 鉴定小区行长5.00m，行距0.60m或0.65m，条播或穴播，每行留苗25株～30株，低于25株时视 为该品种/材料鉴定无效。鉴定种质资源时，每份鉴定材料种植1行；鉴定选育品种时，每份材料种植2 行。土壤肥力水平和耕作管理与大田生产相同。 5 接种 5.1接种时期 接种时期为玉米大喇叭口期(V10)至抽 雄初期 可全天进行 B 5.2接种方法 采用土壤接种法。 侧挖开表土（深约 露出部分根系，将长满腐 霉菌的玉米粒投入土 出 的根系拉 触，每株接 后及时覆土，并保持土壤 的湿润，以使病原菌 能够 米根 组织并从内部向茎髓 RE 5.3接种前后的田间管理√ 因此,接种前土壤应有 有较高的 湿度，接种后若遇干旱，应及时进行田间浇灌，鉴 25%，保证病害发生 所需条 ARCH 6 病情调查 6. 1 调查时间 在玉米进 40 天中完 6.2调查方法 调查者以手 变褐者即为发病 株。计数每份鉴定 6.3病情分级 的 按式(1)计算各鉴定 发病 (1) 式中: X -发病株率,单位为百 发病株数,单位为株； L N 调查总株数，单位为株。 病情分级及相对应的植株发病株率描述见表1。 表1玉米对腐霉茎腐病抗性鉴定的病情级别划分 病情级别 描 述 1 发病株率 0%~5.0% 3 发病株率5.1%~10.0% 5 发病株率10.1%~30.0% 7 发病株率30.1%~40.0% 9 发病株率40.1%~100% 2 NY/T 1248.6—2016 7 抗性评价 7. 1 鉴定有效性判别 当设置的高感对照材料发病株率超过40%时，该批次鉴定视为有效。 7. 2 抗性评价标准 依据鉴定材料发病程度(病情级别)确定其抗性水平,划分标准见表2。 表 2 玉米对腐霉茎腐病抗性的评价标准 病情级别 性 1 高度抗病Highl sistant(高抗HR) 3 抗病 5 7 9 感病 Highly 7.3重复鉴定 若鉴定材料初次鉴定明 ND 表现为高折 折 在买 手进行重 7. 4抗性评价 和重复鉴定结果进行比较，以记载的最高病情级别 定结果，并依此结果对 抗性评价 鉴定材料 进行 8 鉴定结果氵 玉米抗腐 霉茎腐病鉴定结果整理后填人鉴定结果表格，见表 3。 编号 品种种 抗性评价 注1：鉴定地点 注2：接种病原菌 编号及来 注3：接种日期 调查日 负责人（签字)： 3 NY/T 1248.6—2016 附录A （资料性附录） 玉米腐霉茎腐病病原菌 A.1学名和形态描述 肿囊腐霉，学名：Pythium inflatum Matthews 瓜果腐霉,学名:Pythiumaphanidermatum(Edson)Fitzpatrick 异名:Rheosporangium aphanidermatum Edson Nematosporangium aphanidermatum (Edson) Fitzp Pythium butleri Subramanian 禾生腐霉，学名:Pythium graminicola Subramaniam 异名:Pythium graminicola Subramaniam var. stagni Hohnk 棘腐霉，学名：Pythium acanthicum Drechsler 报道还有其他一些腐霉种也能够引起玉米的腐霉茎腐病。 腐霉菌寄主范围广泛，以土壤为主要栖息地，并可以以卵孢子的方式在土壤中存活多年。腐霉菌菌 丝无色、一般无分隔，但老菌丝中可见分隔；菌丝较粗，宽度为4μm～8μm;游动孢子囊形态在不同种间 有差异，球状、手指状、棒状、不规则状等，大小不等；游动孢子肾形，具有双尾鞭，游动一段时间后变为球 器上着生一个或多个雄器；卵孢子满器或非满器。腐霉菌在人工培养基上生长迅速，菌落为圆形。 A.2腐霉菌的培养和保存 水琼脂培养基（Wateragarmedium，WA):琼脂18g～20g，水1000mL。此培养基适用于腐霉菌 的分离，培养温度为25℃。 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potatodextroseagarmedium,PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂 18g～20g，水1000mL。此培养基用于腐霉菌的培养和保存，培养温度为25℃～28℃，保存温度为 10℃~15℃ 皮氏培养液（Petris solution）：此培养液用于诱导腐霉菌游动孢子囊的产生，培养温度为室温。 A.3腐霉菌的扩大培养 采用玉米粒培养基进行扩大培养。玉米粒浸泡12h，然后煮30min～40min，装人三角瓶或耐高温 高压的聚丙烯塑料袋中于121℃下灭菌1h，冷却后将在PDA上培养的病原菌接入三角瓶或塑料袋中， 25℃～28℃下培养。 A.4腐霉菌的分子鉴定 对腐霉菌脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid,DNA）中的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer,ITS)区段进行扩增，上游引物为ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），下游引物 为DC6（5-GAGGGACTTTTGGGTAATCA-3'），扩增片段大小约为1300bp。对扩增片段进行 序列测定，然后与已知腐霉菌的种ITS序列比对，确定分离物的种。 4 NY/T 1248.6—2016 附录B (资料性附录) 玉米腐霉茎腐病抗性鉴定对照材料 B. 1 抗病对照自交系 齐319,对腐霉茎腐病表现稳定的高抗（Highlyresistant,HR)，选自美国玉米杂交种P78599。 B. 2 感病对照自交系 掖478,对腐霉茎腐病表现稳定的高感（Highlysusceptible，HS），选自玉米自交系U8112和沈5003 的组配后代。 5