ICS 65.020 B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1248.112016 玉米抗病虫性鉴定技术规范 第11部分：灰斑病 Technical specification on evaluation of maize resistance to pests- Part 11 :Gray leaf spot 2016-10-26 发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 1248. 11—2016 前 NY/T1248《玉米抗病虫性鉴定技术规范》拟分为13个部分： 第1部分：大斑病； 第2部分：小斑病； 一第3部分：丝黑穗病； 第4部分：矮花叶病； -第5部分：玉米； 第6部分：腐霉茎腐病； -第7部分：镰孢茎腐病； 第8部分：镰孢穗腐病； 第9部分：纹枯病； 第10部分：弯孢叶斑病； 第11部分：灰斑病； 第12部分：瘤黑粉病； 第13部分：粗缩病。 本部分为NY/T1248的第11部分 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由农业部种子管理局提出并归口。 本部分起草单位：吉林省农业科学院植物保护研究所、四川省农业科学院植物保护研究所、全国农 业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所、河北省农林科学院植物保护研究所。 本部分主要起草人：晋齐鸣、李晓、孙世贤、王晓鸣、石洁。 1 NY/T 1248.11—2016 玉米抗病虫性鉴定技术规范 第11部分：灰斑病 1范围 本部分规定了玉米抗灰斑病鉴定技术方法和抗性评价标准。 本部分仅适用于栽培玉米(Zea maysL.）自交系、杂交种、群体、开放授粉品种以及野生玉米和玉米 近缘种对灰斑病抗性的田间鉴定和评价。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 灰斑病gray leaf spot 由尾孢属（Cercospora Fres.）真菌侵染，引起以叶片、叶鞘、苞叶产生灰白色、浅褐色狭长形病斑为 特征的玉米病害。在中国，主要致病种为玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae-maydisTehon et E.Y.Dan iels)和玉米尾孢(Cercospora zeina Crous et U. Braun)。 3尾孢菌接种体制备 3.1病原物分离 以单孢分离法或常规组织分离法从发病植株叶片的典型病斑上分离灰斑病病原物。分离物经形态 学鉴定确认为尾孢菌后，进行纯化培养和致病性测定。 3.2病原物种的鉴定 对用作抗病性鉴定接种体的病原物应进行种的鉴定，依据形态学、培养特征和分子特征（参见附录 A)确定病原物的种级分类地位。 3.3接种体繁殖 接种体繁殖方法为：将在马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar,PDA)培养基平板上培养的病原 菌菌落划碎为小块，接种于加有10个～15个直径5mm玻璃珠的马铃薯蔗糖液体(Potato sucrose,PS) 培养基（100mL)的三角瓶（容量250mL)中，25℃、180rpm/min条件下培养15d后，取0.2mL菌丝悬 浮液涂布于玉米叶粉碳酸钙琼脂（MaizeleafpowderplusCaCO：agar，MLPCA)培养基平板上（参见附 录A），25℃黑暗培养5d～7d,菌落上产生大量分生孢子，即可用于接种。 4抗病性鉴定圃 4.1鉴定圃设置 鉴定圃具备良好的自然发病环境，能够进行田间灌溉和排涝，或具备叶面喷雾设施。 4.2鉴定设计 鉴定材料随机排列或顺序排列。鉴定选育品种时，每份材料种植2行，每15份品种设1组已知高 抗、高感对照材料（见附录B）；鉴定种质资源时，每份材料种植1行，每50份种质设1组已知高抗、高感 对照材料。鉴定小区两端应种植不少于2行的保护行。 4.3种植要求 1 NY/T 1248.11—2016 鉴定材料播种时间与大田生产相同。鉴定小区行长5m，行距与植株密度根据各区域品种试验要 求确定，条播或穴播。对选育品种进行抗性鉴定时，双行留苗≥50株；对种质资源等材料进行抗性鉴定 时，单行留苗≥25株。土壤肥力水平和耕作管理与大田生产相同。 5 接种 5.1接种时期 接种时期为玉米喇叭口期（11叶期)至抽雄初期，接种选择在傍晚或阴天时进行，同批次鉴定材料 应在同一天完成。 5.2接种方法 在田间湿度高的山区采用叶片喷雾法接种。 将不同地点来源的 3 4个尾孢菌菌株分别在 MLPCA培养基平板上培养 子液混合，制备浓度为2. X103 1%吐温20（V/V）。喷雾接 种叶片，接种量为10n /株 在田间湿度较低的平 心叶灌注法接种，将接种悬 浮液在玉米大喇叭口 期以 用 主入植株心叶中 5.3接种时的田间管理 接种后若遇于旱，应及 时 雾，提供病害发 需的适 湿度。鉴定材料全生育期内不喷施农药。同 SEARC! 内完成。 6 病情调查 6.1 调查时间 在玉米进 入孚 行调查，同批次接种、 成调查 6.2调查方法 鉴定 调查者目测每 斗群体的发病状况， 重点部仁 为王米穗位 根据病情级别 划分标准,对每 6.3 病情分级 田间病情分级 相 玉米灰斑病病情分级 病情级别 述 1 穗位叶及上 上部3叶无病斑或有零星病斑，占叶面积 5% 3 穗位叶及上 部 3 叶有少量病斑, 占叶面积6% 5 穗位叶及上部3叶有较多病斑，占叶面积11%~30% 7 穗位叶及上部3叶有大量病斑 病斑相连，占叶面积31 70% 9 穗位叶及上部3叶基本为病斑覆盖,叶片枯死 抗性评价 7. 1 鉴定有效性判别 当设置的高感对照材料发病程度达到感病(7级)及以上时，该批次鉴定视为有效。 7. 2 2抗性评价标准 依据鉴定材料群体发病程度（病情级别)确定其抗性水平，评价标准见表2。 2 NY/T 1248.11—2016 表 2 玉米对灰斑病抗性的评价标准 病情级别 抗 性 高度抗病Highlyresistant（高抗HR） 3 抗病Resistant(抗R) 5 中度抗病Moderatelyresistant（中抗MR） 7 感病 Susceptible(感 S) 9 高度感病Highlysusceptible（高感HS) 7.3重复鉴定 若鉴定材料初次鉴定时表现为高度抗病、抗病、中度抗病,应在第二年进行重复鉴定。 7.4抗性评价 高病情级别为最终鉴定结果,并依此对鉴定 材料进行抗性评价 NY/T 1248. 11—2016 附录A （资料性附录） 玉米灰斑病病原菌 A.1学名和形态描述 引起玉米灰斑病的有多种尾孢菌。 无性态学名：玉蜀黍尾孢Cercospora zeae-maydisTehon et E.Y.Daniels。 无性态学名：玉米尾孢Cercospora zeina Crous et U.Braun。 玉蜀黍尾孢：分生孢子梗褐色至橄榄褐色，通常3根～14根自玉米叶片表皮气孔长出，直立，呈屈 膝状，不分枝，大小为（40～180）μm×（4～8）um；分生孢子无色，倒棍棒形、近圆柱形，顶端钝圆，基部 偶平截,隔膜1个～10个，（30～100）μm×（4～9）μm，脐部略加厚，色暗，宽2μm～3μm。在PDA培 养基培养中菌落呈灰黑色，生长慢，25℃下日生长直径0.5mm～0.8mm，多产生略带红色的尾孢菌素。 玉米尾孢：分生孢子梗浅橄榄色至中褐色，3根～20根松散或成束从叶片表面的气孔长出，直立，近 柱形至屈膝状，不分枝或上部分枝，大小为（40～100）μm×（5～7）μm，隔膜1个～5个；分子孢子无色， 3隔膜～5隔膜，少数10隔膜，宽纺锤形，（60～75）μm×（7～8）μm，少数达100μm，顶端微钝，基部近 平截，脐部略加厚，色暗，宽2μm～3μm。在培养基上生长较慢，25℃下日生长直径约0.4mm，不产生 红色的尾抱菌素。 尾孢菌形态分类学论著见参考文献。 A.2尾孢菌的培养和保存 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g,琼脂18g～20g，水1000mL。马铃薯 蔗糖琼脂(Potato sucrose agar,PSA)培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂18g～20g,水1000mL。此 两种培养基用于尾孢菌的培养和保存，培养温度为25℃～28℃；保存采用斜面试管，保存温度为4℃，保 存期限为一年以上。尾孢菌产孢培养基为玉米叶粉碳酸钙琼脂（MLPCA)培养基：叶粉（玉米中上部绿 叶，干燥后粉碎并经150目筛过筛，保存)15gCaCO32g，琼脂15g，蒸馏水1000mL。 A.3灰斑病病原菌种的分子鉴定 采用H3组蛋白基因进行玉米灰斑病致病尾孢种的特异性鉴定。玉蜀黍尾孢鉴定的上游特异引物 为 CzeaeHIST 5'- TCG ACT CGT CTT TCA CTT G- 3',下游特异引物为 CYIH3R 5'- AGC TGG ATG TCC TTGGAC TG-3';玉米尾孢上游特异引物为CzeinaHIST 5'-TCG AGTGGC CCT CAC CGT-3'，下游特异引物为CYIH3R5'-AGCTGGATGTCCTTGGACTG-3°。PCR反应体系 ddH20定容至25.0μL。反应程序如下：94℃5min预变性，94℃45s，55℃30s，72℃60s，35个循环， 72℃10min。取4.0μLPCR产物在2.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。2个种的特异性扩增片段 大小均为284bp。对扩增片段进行测序和比对，确定种的分类地位， NY/T 1248. 11—2016 附录B (规范性附录) 鉴定结果汇总和对照用自交系 B. 1 鉴定结果汇总表格 玉米抗灰斑病鉴定结果整理后填人鉴定结果表格，见表B.1