ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1186—2017 代替NY/T 1186—2006 猪支原体肺炎诊断技术 Diagnostic techniques for mycoplasmal pneumonia of swine 2017-06-12 发布 2017-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T 1186—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替NY/T1186—2006《猪支原体肺炎诊断技术》。与NY/T1186—2006相比，除编辑性 修改外，主要技术变化如下： “范围”部分增述了临床诊断和实验室诊断，并对实验室检测技术重新调整为病原学诊断与血 清学诊断技术（见第5章和第6章；2006年版的第3章）； “临床诊断与病理学检查”一项综合为临床诊断,并细化为流行病学、临床特征、病理特征和判 定标准，删除了X线检查诊断（见第5章，2006版的第3章）； “病原分离与鉴定”一项归人实验室诊断中,更新了猪肺炎支原体培养基和培养条件，病原鉴定 加人了PCR方法，删除了溶血试验、精氨酸利用试验、薄膜和斑点形成试验、红细胞吸附试验 （见第6章，2006版的第4章）； 新增PCR检测和ELISA检测两种诊断方法（见6.2.2和6.3.2)； 规范了样品采集和运送操作（见6.1）； 增加了综合结果判定说明（见第7章）。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、西北农林科技 大学。 本标准主要起草人：邵国青、冯志新、刘茂军、熊祺琰、张磊、郑增忍、张彦明、白昀、王海燕、武昱孜、 韦艳娜、刘蓓蓓、甘源、华利忠、王丽、张衍海、王娟。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： NY/T 1186—2006。 I NY/T 1186—2017 猪支原体肺炎诊断技术 1 范围 本标准规定了猪支原体肺炎临床诊断、实验室病原学诊断与血清学诊断的技术要求， 本标准适用于猪支原体肺炎人工发病和临床病例的诊断、疫苗免疫效果的确定以及猪场内该病的 净化监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 猪支原体肺炎 猪支原体肺炎（MPS)俗称猪气喘病或猪地方流行性肺炎（EPS)。它是由支原体科支原体属（My coplasma)中的猪肺炎支原体(MHP)引起的一种呼吸道疾病，是严重危害养猪业健康发展的主要猪病 之一。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CCU:颜色变化单位(color change unit) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphates) ELISA:酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay) EPS:猪地方流行性肺炎(enzootic pneumonia of swine) HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase) IHA:间接血凝试验(indirect hemagglutination assay) MHP：猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae） MPS:猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine) PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline buffer) PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) TAE:TAE 电泳缓冲液(tris-acetate-ethylene diamine tetraacetic acid buffer) Taq 酶:Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase) TBE:TBE电泳缓冲液(tris-borate-ethylene diamine tetraacetic acid buffer) 5 临床诊断 5. 1 流行病学 猪气喘病仅发生于猪,不同品种、年龄、性别的猪均能感染。其中，以幼猪最易感，发病率高，病死率 1 NY/T 1186—2017 低。本病一年四季均可发生，猪舍通风不良、猪群拥挤、气候突变、阴湿寒冷、饲养管理和卫生条件不良 均可促进本病发生，加重病情。带菌猪是猪肺炎支原体感染的主要传染源。在许多猪群中，猪肺炎支原 体是从母猪通过接触传染给仔猪。少数猪感染后，就会在同圈猪之间发生接触传染 5.2临床特征 5.2.1急性型 5.2.1.1病猪呼吸困难,严重者张口喘气，腹式呼吸或犬坐姿势，时发痉挛性阵咳。 5.2.1.2食欲大减或废绝，日渐消瘦。 5.2.1.3病程1 周～2 周,病猪可因室息而死。 5.2.2慢性型 5.2.2.1长期咳嗽，清晨进食前后及剧烈运动时最明显，严重的可发生痉挛性咳嗽。 5.2.2.2病猪体温一般正常,但消瘦,发育不良,被毛粗乱。 5.2.2.3病程长达2个月～3个月，有的在半年以上。 5.3病理特征 5.3.1 病理学诊断 5.3.1.1急性病例可见不同程度的肺水肿与肺气肿。在心叶、尖叶、中间叶及部分病例的隔叶前缘出 现融合性支气管肺炎，以心叶最为显著，尖叶和中间叶次之，然后波及隔叶。 5.3.1.2早期病理变化发生在心叶粟粒大至绿豆大，逐渐扩展为淡红色或灰红色，半透明状，界限明 显，俗称“肉变”。 5.3.1.3后期或病情加重，病理变化部颜色转为浅红色、灰白色或灰红，半透明状态减轻，俗称“胰变” 或“虾肉样实变”。继发感染细菌时，引起肺和胸膜的纤维素性、化脓性和坏死性病理变化。 5.3. 2组织病理学诊断 5.3.2.1早期以间质性肺炎为主，以后则演变为支气管性肺炎。支气管和细支气管上皮细胞纤毛数量 减少，小支气管周围的肺泡扩大，泡腔充满多量炎性渗出物，肺泡间组织有淋巴样细胞增生。 5.3.2.2急性病例中,扩张的泡腔内充满浆液性渗出物，杂有单核细胞、中性粒细胞、少量淋巴细胞和 脱落的肺泡上皮细胞。 5.3.2.3慢性病例中,其肺泡腔内的炎性渗出物中液体成分减少，主要是淋巴细胞浸润。 5.4判定标准 猪群出现5.2.1或5.2.2的临床特征，并出现病理特征5.3.1或5.3.2中一条及一条以上，且符合 5.1流行病学，可判定为疑似猪支原体肺炎。 6 实验室诊断 6.1样品采集和运送 6.1.1新鲜肺组织样品采集和运输 按照NY/T 541规定的方法采样。剖检病死猪或发病猪,采集病肺中具有特征病变组织与未见异 常组织连接处的肺组织0.5g～1.0g，置于无菌密封袋或密封容器中，于2℃～8℃下24h内完成运送工 作。如样品不能被及时送到实验室，应置于一20℃以下冰箱中保存。 6.1.2支气管肺泡灌洗液采集和运输 采集新鲜未破损的猪肺脏，经气管注入50mL～100mL灭菌的0.01mol/LPBS溶液（见附录A中 的A.1),轻揉肺脏3min～5min,转移5mL～10mL灌洗液至无菌容器中。运输与保存方法同6.1.1。 6.1.3鼻拭子采集和运输 将猪保定后，采样人员将棉子与猪鼻中隔呈45°角轻轻插人。遇到鼻中隔后，稍作拐弯，绕过骨状 2 NY/T 1186—2017 瓣膜，与鼻中隔平行方向插人2cm～5cm,轻轻旋转棉拭子。当猪出现喷嚏反射后,轻轻抽出棉拭子,将 该鼻拭子样品端置于含有1mL0.01mol/LPBS溶液的火菌离心管中。运输与保存方法同6.1.1。 6.1.4血清样品采集和运输 按NY/T541规定的方法采样。 6.2病原学诊断 6.2.1病原分离与鉴定 6.2.1.1仪器设备 无菌操作台、CO2培养箱、低倍显微镜、移液器、载玻片和微量加样器。 6.2.1.2试剂 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682的要求。 Hank's液（见A.2）、猪肺炎支原体液体培养基（见A.3）、猪肺炎支原体固体培养基（见A.4）、瑞士 染色配套试剂、青霉素。 6.2.1.3分离和培养 将6.1.1采集的肺组织剪成2mm²以下的碎块，用Hank's液洗涤一次； 取3块～5块浸泡在盛有2mL猪肺炎支原体液体培养基（含2000IU/mL青霉素）的西林瓶或试 管中，置37℃传代培养； 第1代～第3代分离时，每3d～5d，以10%～20%的接种量连续进行盲传；随后，每5d～7d连续 传代至第4代～第5代，以提高分离率； 连续传代过程中，如培养物变色，进行涂片镜检。 6.2.1.4染色镜检 瑞氏染色以环形为主，也见球状、两极杆状、新月状、丝状等形态多样、大小不等的疑似菌体（参见附 录B中的B.1）。 6.2.1.5培养鉴定 取0.2mL培养物涂布于猪肺炎支原体固体培养基表面，置37℃、5%～10%COz环境中培养3d~ 10d。若出现圆形、边缘整齐、似露滴状、中央有颗粒且稍隆起的疑似菌落（参见B.2），将其重新接种猪 肺炎支原体液体培养基。待培养物变色后，按照6.2.2的方法做进一步鉴定。 6.2.1.6结果判定 样品呈现出镜检和培养的疑似特征，且猪肺炎支原体PCR检测结果阳性，则判为病猪猪肺炎支原 体分离阳性，表述为检出猪肺炎支原体；否则，表述为未检出猪肺炎支原体。 6.2.2猪肺炎支原体 PCR检测 6.2.2.1仪器 高速