ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1185—2018 代替NY/T 1185—2006 马流行性感冒诊断技术 Diagnostic techniques for equine influenza 2018-03-15 发布 2018-06-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T 1185—2018 目 次 前言 引言 范围 规范性引用文件 3 生物安全措施 4 临床诊断 5实验室诊断 6综合判定 附录 A(规范性附录) 溶液的配制 附录 B(规范性附录) 抗原和血清的处理 NY/T 1185—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替NY/T1185—2006《马流行性感冒诊断技术》。与NY/T1185—2006相比，除编辑性 修改外主要技术变化如下： “引言”部分更正马流行性感冒为三类动物疫病； “病毒分离与鉴定”部分增加收获尿囊液的过程描述（见5.2.5)； “病原分离"部分对血凝试验结果判定进行修正（见5.2.7.2)； -增加了对马流行性感冒病毒核酸鉴定的RT-PCR方法(见5.3); 增加了马流行性感冒抗体单放射免疫扩散溶血试验（见5.5)。 本标准由农业部兽医局提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAT/TC181)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国兽 医药品监察所。 本标准主要起草人：王晓钧、郭巍、戚亭、林健、毛娅卿、蒋桃珍、杨志远。 Ⅱ NY/T 1185—2018 引 马流行性感冒（Equineinfluenza，EI）是由马1型（H7N7亚型）或马2型（H3N8亚型）流行性感冒 病毒(Equine influenza virus,EIV)引起的传染性极强的急性呼吸系统疾病。自然条件下，只有马属动 物易感，包括马、驴、骤，其中马最易感，临床症 发病突然，主要经含有病毒的气溶胶或飞 沫传播，疫情发展迅速，可在短时间内传染马群。本病的潜伏期为1d~ ～3 d,主要症状为发热,流浆液性 或脓性鼻汁，眼部见泪痕或分泌物，咳嗽 般发病马 7d～15 d 后即可恢复健康。本病死亡率较低,如 果继发细菌感染，可引起肺 本病亡年四季均可发生。 我国《一、二、三类动物疫 类动物疫病，是进出口马检疫 必检疫病。 II NY/T 1185—2018 马流行性感冒诊断技术 1范围 本标准规定了马流行性感冒的临床诊断、病原分离、血凝试验(HA)、H3N8 亚型马流感病毒核酸的 RT-PCR、血凝抑制试验(HI)、单放射免疫扩散溶血试验(SRH)的技术要求。 本标准适用于马流行性感冒的流行病学调查、临床诊断和实验室诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文化 Q GB/T 6682 分析实 验室用水 （规格 和试验方法 GB 19489 全通用享 RESI 验 3生物安全措施 S 进行马流行性感冒实验 拉室诊断时如病毒分离，血清处理等按照GB1948 的规定执行。 URA ARC 4临床诊断 4.1 轻症型 此种病型常见 主要 液性鼻 或正常，眼结膜潮红，一般 UL 流水样可 经1周后康复 C 4. 2 重症型 表现精 患马突然发病 愿活动。 ，稽留3d4 d,发热的同时出现 为湿咳有？ 时会 剧烈咳嗽。初 期为流浆液性或黏液 鼻汁 期为 鼻黏膜潮红，眼结膜 充血用 流泪,分泌物增 多。呼吸加快,有的出现 心律不齐 生浮肿 5实验室诊断 5.1样品采集与运输 5.1.1样品的采集 5.1.1.1每个发病群至少选择5匹病畜采集样品，少于5匹则全部采集样品， 5.1.1.2应在临床症状出现后立即采集深部鼻拭子。取样时须将脱脂棉拭子经前侧鼻道伸人鼻腔深 部蘸取呼吸道黏液,取出后立即放人盛有1mL～2mL运输培养液（见附录A中的A.1)的青霉素瓶或 带盖塑料管中。 5.1.1.3血清应采集双份，间隔10d~14d。 5.1.2样品的运输与储存 鼻拭子样品在2℃～8℃时可保存1d～2d，若要长期保存，则应放置于一70℃以下。运送样品时应 加冰块或冰袋冷藏运输。 血清储存应置于一20℃以下。 5. 2 病毒分离与鉴定 1 NY/T 1185—2018 5.2.1仪器设备 恒温培养箱、孵化器、恒温水浴锅、普通冰箱、超低温冰柜、台式离心机。 5.2.2试验材料 96孔V型或U型微量反应板、微量移液器、1mL注射器和5mL注射器、长柄棉拭子（20cm以 上）、青霉素瓶等。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682的规定。甘 油、青霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、0.01mol/LpH为7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)(见A.2)、1%鸡红细 胞悬液(见 A.4)、马流感病毒参考阳性血清和阴性血清、10 d~11 d SPF鸡胚。 5.2.3样品处理 一次仅处理1份样品，从鼻咽拭子中挤出的液体，加人青霉素1000IU/mL～2000IU/mL，链霉素 1mg/mL～2mg/mL。以1500g4℃离心10min,取上清液,经0.22μm滤器过滤后用于SPF鸡胚接 种。未用完的样品放回一70℃以下冰箱保存。 5.2.4样品接种 将孵化至10d11d的SPF鸡胚气室部位用碘和酒精消毒后，在壳上打一个孔。每份样品接种 3枚鸡胚，每胚尿囊腔接种0.2mL。用石蜡封孔,鸡胚放置34℃～35℃孵化器内孵化，丢弃24h内死亡 的死胚,继续孵化至72 h。 5.2.5收获尿囊液 接种后第3d,将鸡胚转到2℃～8℃冰箱中放置4h或过夜。取出后，先将蛋壳表面消毒,用镊子敲 碎并剥离气室蛋壳，然后挑破壳膜和绒尿膜，用注射器收获尿囊液，用1%的红细胞悬液检测尿囊液是 否具有血凝活性（见5.2.7)。每胚收获的尿囊液要分开冷冻保存。 5.2.6种毒选择与保存 为避免缺陷型的病毒粒子产生干扰，要将接种物先作10倍、100倍、1000倍稀释再接种，选择最高 稀释度HA（见5.2.7)呈阳性的样品培养物作为种毒，保存在一70℃以下的冰箱中。 5.2.7 血凝试验(HA) 5.2.7.1操作程序 5.2.7.1.1在反应板每行各孔中加25μLPBS。 5.2.7.1.2第一孔中加25μL病毒分离液,按照1：2 稀释,最后一孔不加抗原作阴性对照。 5.2.7.1.3每孔中再加25μLPBS。 5.2.7.1.4每孔加50μL1%红细胞液，(22±2)℃条件下作用30min。 5.2.7.2结果判定 5.2.7.2.1HA效价判定标准 当红细胞发生凝集反应时,其均匀分布在反应板底部，将血凝板倾斜45°保持20s～30s，红细胞不 下滑；红细胞未出现凝集时，反应板倾斜后，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线或泪滴状。HA效价 为全部红细胞出现凝集时的最高稀释倍数。 5.2.7.2.2样品无血凝活性(HA阴性) 红细胞没有出现凝集时，则需将各样品尿囊液收集在一起，再经鸡胚盲传，当传至第3代仍未出现 血凝活性,判定为马流感病毒阴性。 5.2.7.2.3样品有血凝活性(HA阳性) 将所有血凝试验HA阳性样品作小量等份(每份1 mL)分装在5mL青霉素瓶内,并取其中 1份测 定HA效价，一70℃以下冰箱内保存。有血凝活性（HA阳性)，但效价较低时，要继续传代，共盲传 3代。 5. 2.7.3病原分离结果判定 2 NY/T 1185—2018 HA效价阴性,判定为马流感病毒分离阴性;HA效价阳性,判定为马流感病毒分离阳性,同时要用马 流感病毒 H3N8 亚型和 H7N7 亚型作为参考阳性血清,通过 HI试验(见 5. 4)对病毒样品进行亚型鉴定。 5. 3 H3N8 亚型马流感病毒 RT-PCR 5.3.1仪器设备 PCR仪、微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统。 5.3.2试剂与材料 市售病毒 RNA 提取试剂盒、反转录试剂盒和 PCR 试剂盒;TRIzol 试剂、三氯甲烷、异丙醇、DEPC 处理水、琼脂糖。 可以采用引物HF/HR十MF/MR用于H3N8亚型马流感病毒核酸的检测,详见表1。 表 1 用于 H3N8 亚型马流感病毒 RT- PCR 检测的引物 引物 目的 靶基因 序列(5'～3') 产物,bp HF 正向引物 HA基因 AAT TCA TCA CCC GAG TTC AA HR 595 反向引物 HA基因 TTT CAT TAATCT GGT CGATGGC MF 正向引物 M基因 ACT GTG ACA ACC GAA GTG MR 反向引物 227 M基因 TGC CTG GCC TTA CTA GC 5.3.3样品处理 将拭子充分捻动、挤干后，取100μL样品液至一新的离心管中，进行RNA提取。 5.3.4病毒 RNA的提取 使用市售病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。 也可使用1mLTRIzol试剂处理的样品液，10000g、4℃离心10min，取上清液，静置5min。加200 μL三氯甲烷，振荡混匀15s，静置2min～3min。10000g、4℃离心15min，取上层水相至新的离心管 中，加400μL异丙醇，混匀，静置10min，10000g、4℃离心10min，弃上清液。加75%乙醇1mL，混 匀，10000g、4℃离心5min，去上清液。再加人75%乙醇1mL，混匀，10000g、4℃离心5min，去上清 液。干燥RNA沉淀后,加人100μL DEPC处理过的水溶解。 提取的RNA立即进行RT-PCR反应或一70℃保存。 5.3.5 RT-PCR反应 使用市售合格反转录试剂盒进行反转录。使用市售合格PCR试剂盒进行PCR