ICS 65.020 CCS B 中华人民共和国 林业行业标准 LY/T XXXXX—XXXX LY 白蜡属品种鉴定技术规程 SSR分子标记 法 Technical regulations for the identification of Fraxinus cultivars —SSR marker method (点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 ) （报批稿） 2019 -11 在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。 XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 国家林业和草原局 发布 LY/T XXXXX —XXXX II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由 全国林木种子标准化技术委 员会（SAC/TC 115 ）归口。 本文件起草单位： 山东省林业科学研究院、山东省林木种苗和花卉站、山东农业大学、山东华博基 因工程有限公司。 本文件主要起草人： 燕丽萍、吴德军、王因花、刘翠兰、 李丽、臧真荣、李善文、王开芳、姚俊修、 任飞、李庆华、周继磊、李际红。 LY/T XXXXX —XXXX 1 白蜡属品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 1 范围 本文件确立了利用SSR指纹图谱对白蜡属品种 鉴定的程序。 本文件适用于以白蜡 属（Fraxinus ）品种幼嫩组织（叶片，芽等）为材料，利用 SSR指纹图谱 对白 蜡属品种的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 LY/T 2745 仁用杏品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 3 术语和定义 LY/T 2745 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 待检品种 test cultivar 待鉴定的白蜡属品种，由送检人提供。 3.2 简单重复序列 simple sequence repeats 基因组中由 1个至6个核苷酸组成的 DNA串联重复序列，简称 SSR。 3.3 基因型频率 genotype frequency 群体中某一位点特定基因型个体数占全部个体数的百分比。 4 原理 本文件选用通过转录组测序获得的 17对高度多态性的 EST-SSR引物，用于白蜡 属品种的遗传鉴定。 在检测过程中，采用真实品种的 DNA模板做为 对照品种 ，从待检苗木中抽样做为待检 品种。利用SSR引物 进行扩增， 将待测品种与对照品种的 SSR指纹对比结果进行分析， 若待检品种与对照品种 在任一引物扩 增位点上基因型不同，则可判定待检 品种与标准品种不是同一品种。 当不同引物扩增位点上基因型都相 同时， 可根据标准样品在不同位点上的基因型频率乘积， 计算出待检品种与对照品种是同一品种的概率。 5 主要仪器和设备 仪器设备见附录 A。 LY/T XXXXX —XXXX 2 6 试剂与溶液 主要试剂与溶液配置方法见附录 B。 7 操作程序 7.1 样品 选用白蜡属不同品种幼嫩叶片、嫩芽等组织 0.2 g，提取基因组 DNA。本文件选用已通过国外和国内 审（认）定的白蜡优良品种，见附录 C。 7.2 DNA的提取、纯化及定量 7.2.1 CTAB 法提取DNA CTAB法提取DNA的步骤如下。 a) 将配制好的 CTAB 提取缓冲液置于 65 ℃的水浴锅中预热 30 min，氯仿:异戊醇 (24:1 )、无水乙 醇、70%乙醇置于 -20 ℃冰箱预冷备用，研钵需提前预冷，使用前再用少量液氮预冷。 b) 取0.4 g～0.5 g白蜡幼叶，搁置于研砵中，加入约 30 mL的液氮研磨至粉末状，迅速转入 2 mL离 心管中，加入 600 μL 2%的CTAB 提取液（含 2%β-巯基乙醇），充分混匀。在 65 ℃的水浴锅中 水浴30 min，其间轻轻颠倒 3～4次。 c) 冷至室温后加入 600 μL的氯仿：异戊醇 (24：1)抽提10 min，其间不停地轻轻地摇动，冷却至 室温，在 12 000 r/min 离心10 min。 d) 将上清液（约 500 μL）转入另一离心管中，加等体积氯仿：异戊醇 (24:1)重复步骤 c)。 e) 取出上清液并移到另一个干净的 1.5 mL的离心管中，再加 0.7体积的异丙醇并颠倒混匀沉淀 DNA， 出现絮状 DNA，-20 ℃放置1 h，观察沉淀生成。 f) 8000 rmp室温离心 5 min，倒掉上清液，沉淀用 1 mL75%的酒精洗涤两次，超净工作台静置乙醇 挥发干净。 g) 待DNA风干后( DNA不宜过分 干燥，否则极难溶解 )，用50 μl的TE pH 8.0 或超纯水溶解， 4 ℃ 放置6 h～12 h使其充分溶解。 h) 加入2 μL RNA酶10 mg/mL，37 ℃水浴1 h。 i) 等体积苯酚 -氯仿-异戊醇去蛋白一次，氯仿 -异戊醇去蛋白一次，上层水相中加入 1/10体积的3 M NaAc，两倍体积的无 水乙醇，混匀 -20 ℃放置1到2 h，离心，干燥 DNA，溶于30 μL TE中； -80 ℃ 保存备用。 7.2.2 DNA 定量和质量检测 DNA定量和质量检测的步骤如下。 a) 取2 μLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，可以直接读出 DNA浓度和A260/A280 的比值，比值在 1.8～2.0之间符合要求。 b) 另取取3 μL DNA加等体积 0.2‰的溴酚蓝， 在 0.8%琼脂糖凝胶上电泳 15 min～20 min， 稳压100 V， 电泳缓冲液为 1×TBE，325 nm紫外灯下观察，照相，通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知 DNA的浓度。 c) 植物总DNA样品呈现一条相对分子量较大而迁移速率很小的清晰条带。 d) 将样品DNA用TE稀释成浓度为 20 ng/μL临时保存 -20 ℃保存备用，干燥 DNA长期保存在 -80 ℃ 保存备用。 LY/T XXXXX —XXXX 3 7.3 SSR分析步骤 7.3.1 SSR引物序列表见附录 D。 7.3.2 PCR反应体系为 10 μL，具体见表 1。 表1 PCR扩增体系 试剂 浓度 一个反应所需用量 μL Mix 2倍 5 Primer （F/R） 10 μM 0.1/0.1 DNA 20 ng/μL 1 H2O —— 3.8 7.3.3 反应液加入到 PCR板后，将 PCR板用乳胶盖盖好后放入 PCR仪中，PCR的反应程序如下。 a) 95℃预变性5 min。 b) 95℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共20个循环。 c) 最后72 ℃延伸10 min，4 ℃时10 min终止反应。 7.3.4 PCR产物变性步骤。 a) PCR产物用双蒸水稀释 10～20倍。 b) 取PCR 产物0.3 μL、分子量内标 0.5 μL和去离子甲酰胺 9.5 μL混匀加入 PCR板。 c) 在PCR仪上运行变性程序： 95 ℃变性5 min，4 ℃冷却后离心， 1×Buffer缓冲液上机检测。 7.3.5 PCR产物检测步骤。 a) PCR产物检测采用 DNA基因分析仪。 b) 毛细管的空间校正（新安装的毛细管只要进行一次校正即可）。选择空间校正程序，根据毛细 管是否已经灌胶，选择相应的程序，然后点击开始。空间校正后每个毛细管会有一个峰图，如 果每个毛细管峰值大小基本一致，且每个峰上都有一个“十”，则代表校正通过。 c) 仪器的光谱校正（ 新安装的毛细管只要进行一次校正即可）。取 5 µL Multi-Capillary DS -30 加入195 µL高纯度甲酰胺，混匀后分装到 96孔板A1-H1和A2-H2孔，95 ℃变性5 min，放冰上迅 速冷却。利用光谱校正程序进行光谱校正，选择校正所用的样品型号，然后点击开始校正结束 后通过校正文件图来判断是否正确。 根据 DS-30中的标样， 如果峰图颜色的顺序是蓝、绿、黄、 红，并且峰图清晰、峰型一致则代表光谱校正通过。 d) 采用片段分析程序，选择片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒的类型。创建一个自动分析模 板，填写分析样品的名称，选择样品的类型、内标类别、分析方法等。将变性好的 PCR产物盖 上仪器自带的 PCR板盖后，放入仪器中，用软件中将 PCR板链接到仪器，点击开始进行基因型分 型。 8 待检样品检测的一般程序 对待检品种和对照品种以附录 D中的引物进行标记检测，获得待检品种和对照品种在这些位点的等 位变异数据，利用这些数据进行比较，判定方法如下。 a) 随机选取一引物，对待检品种进行 PCR扩增。 LY/T XXXXX —XXXX 4 b) 将扩增得到的条带和附录 E中的标准谱带相比较，若待