ICS 65.020 B 60 LY 中 华 人 民 共 和 国 林业行 业 标 准 LY/T 3191—2020 林木DNA条形码构建技术规程 Technical regulations of DNA barcodes in woody spec ies 2020 - 03 - 30发布 2020 - 10 - 01实施 国家林业 和草原 局 发布 LY/T 3191 —2020 I 前 言 本标准按照 GB/T1.1 —2009给出的规则起草。 本标准由 国家林业和草原局提出。 本标准由 全国林木种子标准化技术委员会（ SAC/TC115 ）会归口。 本标准起草单位： 中国林业科学研究院 热带林业研究所 ，湖南省林业科 学院，中国科学院华南植物 园，中国科学院植物研究所 ，江西农业大学林学院 。 本标准主要起草人： 裴男才、梁军生、陈步峰、葛学军、米湘成、刘娟。 LY/T 3191 —2020 1 林木 DNA条形码构建技术规程 1 范围 本标准规定了 林木 DNA条形码构建中样本采集策略、核心 DNA条形码片段选取标准、 DNA提取 技术和保存、序列测定和编辑 方法、系统发育关系构建 等技术要求 。 本标准适用于 林木 DNA条形码的构建。 2 规范性引用 文件 下列文件 对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（ 包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 SN/T 4625 -2016 DNA 条形码筛选与质量要求 SN/T 4626 -2016 DNA 条形码物种鉴定操作规程 SN/T 4714 -2016 DNA 条形码数据库技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 DNA条形码 DNA barcod es 是从线粒体、叶绿体或核基因 组区域中筛选的一段短的通用的 DNA序列，以期对现存生物在物种 水平上进行快速而准确的识别和鉴定。 3.2 引物 Primer 是一小段单链 DNA或RNA，作为 DNA复制的起始点，在核酸 合成反应时，作为每个多核苷酸链进 行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。 3.3 聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction (PCR ) 一种体外酶促合成特异 DNA片段的方法，由高温变性、低温退火 及适温延伸等几步反应组成一个 周期，循环进行，使目的 DNA得以迅速扩增 ，具有特异性强、灵敏度高、操作简便 省时等特点。 3.4 DNA序列 DNA sequence LY/T 3191 —2020 2 多核苷酸链中的核苷酸的排列顺序。可能的字母只有 A、C、G和T，分别代表组成 DNA的四种核苷 酸——腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶 ；无间隔地排列在一起，例如序列 AAAGTCTGAC 。 3.5 DNA测序 DNA sequencing technology 对DNA分子的核苷酸排列顺序的测定，也就是测定组成 DNA分子的 A、T、G、C的排列顺序。 3.6 系统发育关系 Phylogeny 生物有机体随着时间变化而呈现的起源 、演化历史 及其亲缘关系 。 3.7 简约法系统发育分析 Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and Other Methods) (PAUP ) 一款用于构建进化树 (系统发育树 )及进行相关 检验的软件，包含了众多分子进化模型和方法，可利 用最大似然法、简约法、距离法等分析分子数据 (DNA、蛋白质序列 )、形态数据及其他类型数据。 3.8 系统发育研究 赛百平台 Cyberinfrastructure for Phylogenetic Research ( CIPRES ) 一款为科研机构和研究人员设计和开放的远程超级计算机平台，可满足巨量数据的运行要求，能大 幅节约时间成本，提高运算结果的可靠性。 3.9 分子进化遗传分析软件 Molecular Evolutionary Genetics Analysi s (MEGA ) 一款操作便捷 、功能强大的分子进化遗传分析 免费开源 软件，可与其他在线公共超算平台互补。 3.10 DNA条形码系统发育 R包 Phylotools 一款可自动进行大规模 DNA序列排列和比对的软件，可构建基于多个条形码片段的 超级矩阵 ，获 取群落水平系统发育关系。经过 非参数速率平滑 NPRS法(r8s)转换后的进化树，就可以进行相应的群落 系统发育分析 。此外， 可根据实际情况增加 MAFFT等算法更新 、运行速度更快的比对软件，获得更准 确的分析结果。 4样本采集策略 4.1 采集部位 。干净的成熟叶片 最佳，特殊情况下可采集 枝条、树根和树皮韧皮部等材料 ；避免采 集被虫咬、有病菌的叶片 。 4.2 样品重量 。阔叶树叶片 5-10片，细羽状复叶或针叶树叶片 5-10克；足够用于 DNA提取。 4.3 样品数量 。常见种 3-5个来源于不同居群的 个体，稀有种尽量多采集 ；避免样品中出现错误鉴 定的物种 。 4.4 样品编号 。结合样地中物种号和树牌号进行编号；多个个体时，需作区分；如樟树 -1(+树牌号 )， 樟树 -2(+树牌号 )。详细记录采集时间 。 LY/T 3191 —2020 3 4.5 样品保存 。直接将材料置于封口袋，在封口袋中倒入干净的硅胶；或将材料放入空茶包中，可 不与硅胶直接接触，确保材料不受污染 。若材料含水量较高，注意及时换新的硅胶，保证材料品质；正 常情况下硅胶颜色深蓝， 若吸水较多，硅胶颜色将变为浅紫红，此时需换新的硅胶 。条件允许的情况下， 对一些叶片材料不容易提取 DNA的样品可以采用冷藏保存。 4.6 凭证标本 。植株整体 /局部、大生境 /微生境的照片和信息，记录 伴生种及经纬度 等。凭证标本 要求带花或果实的枝条 ；无花或果实时，则用带叶的枝条 。记录树 木的标牌号以及与自封口袋上的样品 编号。每个样点和每个物种采集 3份以上凭证标本； 采集后当天压制，最后统一交付标本馆保存 。 5 核心 DNA条形码片段选取标准 5.1 进化速率 。进化速率较慢的片段可以锚定目标物种到 科/属的较高分类等级， 化速率较快的片段 则可将近缘类群进行识别和分辨 。 5.2 分辨能力 。种间有明显的遗传变异，而种内变异足够小；片段所含的变异位点多 则分辨力高； 进化速率较快 的片段比进化速率较慢 的片段有更高分辨力；组合片段比单个片段提供更多的变异位点 。 5.3 片段长度 。足够短，减少测序工作，且便于 DNA提取和 PCR扩增，尤其是对存在 DNA降解的材 料(如：保存已久的腊叶标本、处理过的民间药材 )；降低测序费用 ；不同物种间序列长度变异 尽可能小 。 5.4 片段通用性 。存在保守区域，便于设计通用引物 。也可以从已发表的基因组、转录组数据中筛 选合适的 DNA片段作为特定物种的条形码。 6 DNA提取技术和保存方法 6.1 CTAB法。对少数富含次生代谢物质或油脂的物种 (如樟科、桑科植物 )，在 CTAB程序之前增加 冰浴步骤以消除影响 。详见附录 I。 6.2 试剂盒法 。一般推荐离心柱型 ，具体操作步骤可在所用试剂盒说明书上获得。 6.3 DNA保存方法。 所有提取出的 DNA，经过电泳检测之后，一部分保存在 -80℃冰柜长期保存备 用，一部分放置在 -20℃冰箱中用于后续实验 。 LY/T 3191 —2020 4 7 PCR扩增及测序 7.1 PCR扩增反应体系 (如下表)。 条目 体积 Genomic DNA 0.5 μL 10× buffer ( 无MgCl 2) 3 μL MgCl 2 (视情况添加 ) 2 μL dNTPs (2 mmol L–1) 0.5 μL Forward Primer (10 mmol L–1) 1 μL Reverse Primer (10 mmol L–1) 1 μL Taq E (5U μL–1) 0.5 μL ddH 2O 加至总体积 30 μL 总体积 30 μL 7.2 PCR扩增反应策略 。根据引物测序长度， PCR扩增反应策略可分为两类 ；具体如下表 。 类别 片段 PCR扩增程序 较短片段 rbcLa、trnH-psbA 和ITS2 95° C变性 3分钟，接着是 35个循环的 95° C变性 30秒+51 ° C退火 30秒 +72 ° C延伸 1分钟，最后是 72° C延伸 7分钟。退火的温度变化幅度可在 48-53° C之间调整 较长片段 matK和ITS 95° C变性 3分钟，接着是 35个循环的 95° C变性 30秒+51 ° C退火 30秒 +72 ° C延伸 90秒，最后是 72°C延伸 7分钟。退火的温度变化幅度可在 48-53° C之间调整；循环数可增加至 40 7.3 序列测定策略 测序使用 ABI系列自动测序仪 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA )。 测序引物使用 PCR 扩增引物。测序时需提供 PCR产物和相应引