SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1632.2—2013 代替SN/T1632.2—2005 出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属） 检验方法第2部分：PCR方法 Determinetion of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp. )from dehydrated powdered milk for export-Part 2:PCR method 行业标准信息服务平台 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1632.2—2013 前言 SN/T1632《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法》共分为3个部分： 第1部分：分离与计数； 第2部分：PCR方法； 第3部分：荧光PCR方法。 本部分为SN/T1632的第2部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分与SN/T1632.2一2005相比，主要技术变化如下： 本标准按照GB/T1.1一2009规范了文本格式； 修改了标准的中英文名称； 删除了定义、术语和缩略语； 删除了分离培养基结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：张霞、刘培、赵贵明、高旗利、吴冬雪、张海英、曲鹏、赵良娟、张宏伟。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1632.2—2005。 行业标准信息服务平台 I SN/T 1632.2—2013 出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属） 检验方法 第2部分：PCR方法 1范围 本部分适用于奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的快速定性检测，其他食品可参照执行 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1632.1奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）第1部分：分离与计数方法 3设备和材料 3.1天平：量程2kg，感量0.1g。 3.2水浴箱：保持水温44.5℃土0.2℃ 宁业标准信 3.3培养箱：35℃~37℃和43℃~45℃ 3.4 PCR仪。 3.5离心机。 3.6紫外凝胶成像仪。 3.7电泳仪。 3.8 pH计。 忘服务平台 3.9 41 培养基和试剂 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规定。 4.1改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（mLST-Vm）（见附录A中A,1）。 4.2 脑心浸液（BHI)（见A.2）。 4.3营养肉汤（NB)（见A.3）。 4.4 引I物SAKAF:5-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3';SAKAR:5'GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3 4.5TaqDNA聚合酶。 4.6 dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 4.7 10XPCR缓冲液。 阪崎肠杆菌质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。 4.9 DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。 1 SN/T 1632.2—2013 4.10 TE缓冲液:10mmol/LTris-HCI(pH8.0)、1mmol/LEDTA(pH8.0)。 4.11琼脂糖：分析纯。 4.12GelRed或GelGreen核酸染色剂。 4.13分子量标记：100bpDNAladder。 4.145×TBE电泳缓冲液：Tris54g、硼酸27.5g、0.5mol/LEDTA(pH8.0)20 mL,加蒸馏水至 1000mL，使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。 4.156×加样缓冲液。 4.16 克罗诺杆菌显色培养基（见A.4）。 阪崎肠杆菌检验方法 5.1方法提要 奶粉经增菌后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩 属)进行快速检测。 5.2检验程序 见图1。 样品100g加到900mLmLST-Vm中 44℃ 22h~24h 0.2mLmLST-Vm增菌液加到5mLBHI中 36℃±1℃ 水浴4h PCR检测 阴性 阳性 服务平台 确证试验 报告 图1 阪崎肠杆菌PCR检测程序 5.3步骤 5.3.1增菌 无菌称取奶粉试样100g，加到已预热的（45℃）装有900mLMLST的2L三角瓶中，振摇使样品 充分混匀后，44℃恒温培养22h～24h。在液面1cm以下取MLST增菌液0.2mL加到装有5mL