HJ 中华人民共和国国家环境保护标准 HJ1069--2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法 Water quality-Determination of the acute toxicity Zebrafish (Danio rerio) eggs method 刮涂层查真伪 2019-12-31发布 2020-06-30实施 生 态 环 境 部发布 HJ1069—2019 中华人民共和国生态环境部 公告 2019年第59号 为贯彻《中华人民共和国环境保护法》，保护生态环境，保障人体健康，规范生态环境监测工作， 现批准《水质 急性毒性的测定斑马鱼卵法》等15项标准为国家环境保护标准，并予发布。 标准名称、编号如下。 《水质 急性毒性的测定斑马鱼卵法》（HJ1069—2019） 《水质 15种氯代除草剂的测定气相色谱法》（HJ1070—2019） 三、 《水质 草甘麟的测定高效液相色谱法》（HJ1071—2019） 四、《水质 吡啶的测定顶空/气相色谱法》（HJ1072—2019) 五、《水质 萘酚的测定高效液相色谱法》（HJ1073—2019） 六、《水质 三丁基锡等4种有机锡化合物的测定液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》 (HJ1074—2019) 《水质 浊度的测定浊度计法》（HJ1075—2019） 八、 《环境空气氨、甲胺、二甲胺和三甲胺的测定离子色谱法》（HJ1076一2019） 九、 《固定污染源废气油烟和油雾的测定红外分光光度法》（HJ1077—2019) 十、《固定污染源废气甲硫醇等8种含硫有机化合物的测定气袋采样-预浓缩/气相色谱-质谱法》 (HJ1078—2019) 十一、《固定污染源废气氯苯类化合物的测定气相色谱法》（HJ1079一2019） 十二、《固定污染源废气氟化氢的测定离子色谱法》（HJ688一2019） 十三、《土壤和沉积物铊的测定石墨炉原子吸收分光光度法》（HJ1080一2019） 十四、《土壤和沉积物钴的测定火焰原子吸收分光光度法》（HJ1081一2019） 十五、《土壤和沉积物六价铬的测定碱溶液提取-火焰原子吸收分光光度法》（HJ1082一2019） 以上标准自2020年6月30日起实施，由中国环境出版集团有限公司出版，标准内容可在生态环境 部网站（http：//www.mee.gov.cn）查询。 特此公告。 生态环境部 2019年12月31日 HJ 1069—2019 目 次 前言， 1适用范围 2规范性引用文件 3术语和定义 4方法原理. 5干扰和消除 6试剂和材料. 仪器和设备.. 8样品. 9 试验步骤 10结果计算与表示 6 11 有效性、敏感性与精密度 12 质量保证和质量控制 13 试验报告 14废弃物处置 附录A（资料性附录） 斑马鱼卵相关发育阶段 附录B（资料性附录） 斑马鱼种鱼驯养及维持， ..9 附录C（资料性附录） 产卵盒参考图片. 10 附录D（资料性附录） 斑马鱼卵鉴别.. 附录E（资料性附录） 24孔细胞培养板试验布局设置方案 14 附录F（资料性附录） 推荐的数据记录表 附录G（资料性附录） 寇式法计算ECs 17 ili HJ1069—2019 前言 为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障 人体健康，规范水质急性毒性测定的斑马鱼卵方法，制定本标准。 本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中急性毒性的斑马鱼卵法， 本标准的附录A～附录G为资料性附录。 本标准为首次发布。 本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。 本标准起草单位：江苏省常州环境监测中心、中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实 验室。 本标准验证单位：中国环境科学研究院环境分析测试技术中心、中国环境监测总站、生态环境部南 京环境科学研究所、浙江省环境监测中心、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所和江苏国创环保科 技有限公司。 本标准生态环境部2019年12月31日批准。 本标准自2020年6月30日起实施。 本标准由生态环境部解释。 iv HJ1069—2019 水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法 1适用范围 本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。 本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。 2规范性引用文件 本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是未注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6920水质pH值的测定玻璃电极法 GB/T13267水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法 HJ91.1污水监测技术规范 HJ506水质溶解氧的测定 电化学探头法 HJ/T91地表水和污水监测技术规范 HJ/T164地下水环境监测技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 鱼卵 fish egg 指处于卵膜破裂前整个发育阶段的卵细胞，斑马鱼卵相关发育阶段参见附录A。 3.2 稀释倍数dilutionlevel 原水样占稀释后水样总体积分数的倒数，一般用D来表示。例如，水样未稀释，则稀释倍数D=1； 取250ml水样稀释至1000ml（即体积分数为25%），则稀释倍数D=4。 3.3 最低无效应稀释倍数lowestineffectivedilution 测试中不产生测试效应的最低稀释倍数，本标准指不少于90%鱼卵存活时水样的最低稀释倍数， 用LID表示。 3.4 半数效应浓度EC50 指暴露48h后使50%斑马鱼卵产生效应的原水样占稀释后水样总体积的百分数，用EC50表示。本 标准中EC5o即半数致死浓度LC50。 3.5 参比物质referencesubstance 测试中，用于验证方法敏感性的已知阳性对照物质，如本标准中3,4-二氯苯胺。 1 HJ1069—2019 4方法原理 使用多孔细胞培养板，在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下，将4-细胞期128-细胞 期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中，在26℃士1℃的条件下培养48h，根据鱼卵存活与死亡 的统计数据计算LID或EC5o值，表征水样的急性毒性。 5干扰和消除 水样浊度或色度干扰测试终点判断，可用塑料滴管（7.11）缓慢从多孔细胞培养板（7.8）中吸出一 定量的水样后再行观测，避免触碰鱼卵；观测结束后，若需继续暴露，则用塑料滴管（7.11）将原水样 移回，恢复原有暴露体积。 6试剂和材料 6.1 受试生物 6.1.1种鱼 使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长3.5cm 左右，鱼龄在6～24月。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体型修长，腹部扁平，身体带有金黄 色光泽。种鱼在产卵前6个月不予使用任何药物。种鱼驯养及维持具体条件见附录B。 6.1.2鱼卵 确保试验鱼卵受精率≥70%，处于4-细胞期～128-细胞期（见附录A）。 6.2试剂 除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去离子水，满 足pH为6.5～8.5，电导率<10μS/cm的要求。 6.2.1氢氧化钠（NaOH）。 6.2.2 氯化钙（CaCl22H2O）。 6.2.3硫酸镁（MgSO47H2O)。 6.2.4 碳酸氢钠（NaHCO3）。 6.2.5氯化钾（KCI)。 6.2.63,4-二氯苯胺（CHsCl2N)，优级纯。 6.2.7盐酸：p（HCI）=1.19g/ml。 6.2.8盐酸溶液：c（HCI）=0.1mol/L。 量取8.3ml盐酸（6.2.7），用水定容至1000ml。 6.2.9氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.1mol/L。 称取4g氢氧化钠（6.2.1)，溶于少量水中，用水定容至1000ml。 6.2.10参比物质3,4-二氯苯胺贮备液：p（CHsCl2N）=100mg/L。 称取0.05g3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量标准稀释水（6.2.16）中，用标准稀释水（6.2.16）定 容至500ml，静置24h，调节pH至7.0。避光冷藏保存，贮备液可贮存6个月。 6.2.11参比物质3,4-二氯苯胺工作液：p（CHsCl2N）=3.7mg/L。 量取3.7ml参比物质3,4-二氯苯胺贮备液（6.2.10），用溶解氧浓度达空气饱和值的标准稀释水 2 HJ1069—2019 （6.2.16）定容至100ml，使用前按8.2.1步骤平衡至26℃土1℃。该溶液作为阳性对照，临用前现配。 6.2.12氯化钙备液：p（CaCl2:2H2O）=11.76g/L。 称取11.76g氯化钙（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可贮存6个月。 6.2.13硫酸镁贮备液：p（MgSO47H2O）=4.93g/L。 称取4.93g硫酸镁（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可存6个月。 6.2.14碳酸氢钠贮备液：p（NaHCO3）=2.52g/L。 称取2.52g碳酸氢钠（6.2.4)，.溶于少量水中，用水定容至1000ml。可贮存6个月。 6.2.15氯化钾贮备液：p（KCI）=0.22g/L。 称取0.22g氯化钾（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可贮存6个月。 6.2.16标准稀释水。 将氯化钙贮备液（6.2.12）、硫酸镁贮备液（6.2.13)、碳酸氢钠贮备液（6.2.14)和氯化钾贮备液（6.2.15） 四种贮备液各25ml混合，用水定容至1000ml。 7仪器和设备 冷藏采样箱：2~8℃； 7.2 pH计：测量范围0～14，最小分度为0.1pH单位； 7.3 溶解氧测定仪：测量范围0~20mg/L，最