SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1612—2013 代替SN/T1612—2005 香石竹环斑病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Carnation ringspot virus 行业标准信息服务平台 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1612—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1612一2005《香石竹环斑病毒血清学检测方法》。 本标准与SN/T1612一2005相比，主要技术变化如下： 增加了免疫捕获RT-PCR检测方法； 增加了免疫电镜检测方法； 增加了实时荧光RT-PCR检测方法； 增加了香石竹环斑病毒相关资料的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国上海出入境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人：杨翠云、于翠、胡培龙、陶廷典、崔学慧、于子翔。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1612—2005。 行业标准信息服务平台 I SN/T1612—2013 香石竹环斑病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准主要规定了进境种苗中香石竹环斑病毒的DAS-ELISA，免疫电镜、免疫捕获RT-PCR和实 时荧光RT-PCR等检疫鉴定方法。 本标准适用于进境种苗中香石竹环斑病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法 3香石竹环斑病毒基本信息 中文名：香石竹环斑病毒 英文名：Carnation ringspot virus 缩写：CRSV 分类地位：番茄丛矮病毒科（Tombusviridae），香石竹环斑病毒属（Dianthovirus） 传播途径：该病毒通过无性繁殖材料的运输进行长距离传播，近距离主要是由于植物间的接触、土 壤污染和农事操作等引起病毒传播。 香石竹环斑病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 香石竹环斑病毒具有中等到强的免疫原性，易获得高质量的多抗血清，属内病毒之间有较弱的血清 学交叉反应。 以香石竹环斑病毒的抗血清，采用DAS-ELISA或者免疫捕获RT-PCR进行病毒初筛，如果样品阳 性，则采用实时荧光RT-PCR、免疫电镜或者鉴别寄主反应，对阳性材料进行验证两种及以上方法可 进行病毒种类的检疫鉴定。 5仪器设备、用具和试剂 5.1仪器设备 酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像 系统、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器 5.2用具 可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）及相应的无RNase吸头、无 1 SN/T1612—2013 RNase离心管、PCR管和研钵等。 5.3主要试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。CRSV血清检测试剂、植物总RNA提取试剂盒、 RNA反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附 录 B。 6病毒检测 6.1样品制备 将送检样品中有疑似病毒为害症状的植物组织放人研钵内研磨，并按重量和病毒抽提缓冲液1：10 症状描述参见附录A。 6.2双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA） 按6.1方法进行样品制备获得的上清液用于DAS-ELISA检测。同时，设置阴性对照、阳性对照和 空白对照，阴性对照的种类和材料应该尽量与所检测样品类型相一致。具体操作步骤见附录C。 6.3免疫捕获RT-PCR方法（IC-RT-PCR） 先用香石竹环斑病毒抗血清包被PCR管，洗涤后在PCR管中加入6.1制备的上清液，进行免疫捕 获，然后反转录获得cDNA，再进行PCR反应。具体操作步骤见附录D。 6.4实时荧光RT-PCR方法 采用6.3方法获得cDNA，进行实时荧光PCR反应。也可按照植物总RNA提取试剂盒的规定提 取样品中的RNA，反转录后再进行实时荧光PCR反应。具体操作步骤见附录E。 6.5免疫电镜方法 利用香石竹环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特 征，具体操作步骤按照SN/T1840规定进行。如观察到直径为34nm的球状病毒粒子，即可判定免疫 电镜结果阳性。 7结果判定 样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR检测为阴性时，可判定样品不携带香石竹环斑病毒。 样品经DAS-ELISA和IC-RT-PCR检测为阳性时，且扩增产物序列与CRSV有高度同源性时，可 判定样品携带香石竹环斑病毒。 样品经DAS-ELISA或IC-RT-PCR其中一种方法检测为阳性时，需要用实时荧光RT-PCR、免疫 电镜方法或者鉴别寄主反应其中的任何一种方法进行验证，如果实时荧光RT-PCR阳性、免疫电镜方 2