ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA 法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 Forensic sciences – Methods for d etection of rbcL gene of diatom – Capillary electrophoresis and fluorescence method （报批稿） ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T XXXX—XXXX GA/T XXXX—XXXX I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会（ SAC/TC 179 ）提出并归口。 本文件起草单位： 广州市刑事科学技术研究所 、 中山大学、 广东省公安厅。 本文件主要起草人： 刘超、徐曲毅、刘宏、赵建、肖成、李越、汪冠三、刘长晖、杨幸怡、徐际超。 GA/T XXXX—XXXX 1 法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 1 范围 本文件规定了法医物证检验水中尸体组织中硅藻的材料准备、操作方法、 PCR扩增硅藻 叶绿体核 酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基基因 特异片段和实时荧光定量检验结果判定及注意事项。 本文件适用于法庭科学检验中对硅藻 rbcL基因片段的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GA/T382-2014 法庭科学 DNA实验室建设规范 GA/T383-2014 法庭科学 DNA实验室检验规范 3 术语和定义 下面界定的术语和定义适用于本文件。 3.1 rbcL基因 rbcL gene 叶绿体核酮糖 -1,5-二磷酸羧化酶大亚基基因 。 4 原理 在溺死过程中，肺泡 -毛细血管屏障损伤导致水中的浮游生物（如硅藻）随溺液进入血液循环， 从而到达人体内各器官。检测这些浮游生物的存在，可用于诊断溺死。溺死相关硅藻（舟形藻、菱形 藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻、骨条藻等）的叶绿体中含有 rbcL基因，该基因片段与人类 及共生 菌没有同源性。在水中尸体的体循环器官（肝脏或肾脏）中检测到该基因的 特异片段 ，可证实溺死相 关硅藻DNA的存在。 5 仪器设备 包括： a) 可调微量移液器（ 2 μL，10 μL，100 μL，1000 μL）； b) 高速台式冷冻离心机 ，可控温至 4 ℃且离心速度可达 12000 r/min 以上； c) PCR扩增仪； d) 实时荧光定量 PCR扩增仪； e) 毛细管电泳仪； GA/T XXXX—XXXX 2 f) 超净工作台； g) 高压灭菌锅； h) 涡旋仪。 6 试剂耗材 6.1 DNA提取试剂，以 Powersoil 土壤DNA提取试剂盒为例： a) 细胞裂解液，常温保存； b) 石英砂，常温保存； c) 20 mg/mL蛋白酶K，4 ℃保存； d) 抑制因子去除溶液，常温保存； e) 蛋白沉淀溶液，常温保存； f) DNA结合盐溶液，常温保存； g) 硅膜离心纯化柱，常温保存； h) 乙醇冲洗液，常温保存； i) DNA溶解液，常温保存。 6.2 参考SYBR Green 实时荧光定量 PCR扩增试剂及引物： a) rbcL（F）：5’ CTCAACCATTCATGCG 3’ ； b) rbcL（R）：5’ CTGTGTAACCCATAAC 3’ ； c) SYBR Green PreMix 荧光染料预混酶； 5 U/ μL，-20 ℃保存。 6.3 参考PCR-CE扩增电泳试剂及引物： a) rbcL（F）：5’FAM- CTCAACCATTCATGCG 3’ ； b) rbcL（R）：5’ CTGTGTAACCCATAAC 3’ ； c) PCR PreMix Taq 酶；5 U/ μL，-20 ℃保存； d) 甲酰胺； e) 分子量内标（ 75 bp ~500 bp）； f) POP-4胶； g) 纯水； h) 透明薄壁 PCR管（0.2 mL）； i) 96孔微孔板； j) 离心管（ 0.5 mL和2 mL）。 7 实验室环境要求 符合GA/T382-2014的要求。 8 操作步骤 GA/T XXXX—XXXX 3 8.1 样本准备 8.1.1 剪取尸体的肺、肝、肾样本各 0.5 g，加入600 μL DNA提取裂解液，匀浆裂解； 8.1.2 样本匀浆裂解液，按照 DNA提取试剂盒使用说明提取 DNA，调整DNA浓度至0.5~1.0 ng/μL， -20 ℃分装保存待检。 8.2 实时荧光 定量PCR检测 采用20 μL qPCR反应体系： SYBR Premix Ex Taq II （2×）：10 μL，正向引物及反向引物各 0.5 μL，DNA模板2 μL，纯水7 μL，反应参数见附录 A中A.1。 8.3 PCR-CE毛细管电泳分离检测 8.3.1 样品PCR准备 8.3.1.1 取出冷藏的 PCR-CE扩增试剂使其温度达到室温，轻弹混匀，离心。 8.3.1.2 准备扩增样品、阳性对照、阴性对照、 PCR反应管，编号并进行扩增， PCR-CE扩增体系为 20 μL，并参照附录 A中A.2计算反应用量。 8.3.1.3 按照计算结果混合各种成分，混匀、离心，分装到透明薄壁 PCR管内。 8.3.1.4 将透明薄壁 PCR管放入扩增仪中，见附录 A中A.3中设定的程序运行。 8.3.1.5 扩增产物置于 4 ℃保存。 8.3.2 毛细管电泳分离检测 8.3.2.1 在1 mL甲酰胺中加入 50 μL分子量内标，配制成上样混合液，涡旋混匀。 8.3.2.2 在96孔微孔板的 样本测试孔中，加入 10 μL上样混合物和 1 μL扩增产物， 3000 r/min 离 心30 s，去除气泡 。 8.3.2.3 95 ℃变性3 min，立即放 置冰上冷却 3 min，待测。 8.3.2.4 将加样变性后的 96孔微孔板，置于遗传分析仪中进行电泳检测。详细电泳步骤参见 毛细管 电泳仪厂家配套的操作手册。 8.3.2.5 电泳完毕后，使用数据分析软件进行分析，获得扩增产物的片段长度。详细分析步骤参见 分析软件厂家配套的操作手册。 9 结果判断 9.1 根据实时荧光定量 PCR仪的数据分析软件使用说明（以 QuantStudio™ 6 and 7 Flex Real -Time GA/T XXXX—XXXX 4 PCR System Software, v1.0 为例），若 Ct值小于等于 35，且呈现典型的扩增曲线，则可判定为阳 性结果，样品扩增曲线参考附录 A中A.4，熔解曲线参考附录 A中A.5；若Ct值大于35，或无扩增信 号，则可判定为阴性结果。 9.2 当扩增产物电泳分析结果，出现特异性片段的荧光峰，则表明该检测样本含有硅藻。样品检测 结果参照附录 A中A.6。不同批次检测的标准株阳性对照样本的特异性片段可能有长度差异，结果判 断时按10.6判定。 9.3 当电泳分析结果未出现荧光峰时，样本仍有可能含有硅藻，需做进一步的检测分析。 10 注意事项 10.1 扩增试剂与检测试剂需分开保存： Premix Taq 酶于-20 ℃保存；荧光引物、分子量内标需 4 ℃ 避光保存，长期保存需置于 -20 ℃。 10.2 有效检测信号峰值应大于 150 RFU（RFU：相对荧光单位）以上。当检测信号峰值超过仪器检测 最高阈值时，应减少上样量重新电泳检测。 10.3 检验中应做已知标准藻株的阳性对照、空白对照和非溺死的人类 DNA的阴性对照。 10.4 在阳性对照和阴性对照均正确的前提 下，样品检验过程方可判定为可靠。 10.5 本文件中所列分析数据为使用遗传分析仪电泳检测（以 3500遗传分析仪检测和 GeneMapper® ID-X软件分析为例），系统误差为± 0.5 bp。不同的检测条件可能会导致样本检测结果出现系统误差， 需参考同批次检测的阳性对照结果进行分析。 10.6 应使用硅藻标准株（舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻、骨条藻等）提取 DNA制 作阳性对照样本与尸体样本同步按 8.3的方法进行扩增检测，两者均出现特异性扩增峰结果时，可判 定尸体样本结果为阳性。 10.7 若实时荧光定量 PCR的扩增曲线未出现平台期，呈非典型扩增，可适当增加循环数，重新检测。GA/T XXXX—XXXX 1 附录 A （资料性） 法庭科学 硅藻rbcL基因特异片段检 测 毛细管电泳