_--______ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T XXXX—XXXX 法庭科学 家猪STR复合扩增检验 毛细管 电泳荧光检测法 Forensic science - STR multiplex amplification examination methods for Sus scrofa f . domestica -Capillary electrophoresis and fluorescence method （报批稿） ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T XXXX —XXXX I 前 言 本文件按照GB/T 1.1 -2020给出的规则起草。 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会（ SAC/TC 179 ）提出并归口。 本文件起草单位：公安部物证鉴定中心 、海口市公安局、南京森林警察学院、湛江市公安局 。 本文件主要起草人：张颖、马温华、张瑾、金鑫、马艳君、刘开会、李万水 、林大钧等。 GA/T XXXX —XXXX 2 法庭科学 家猪STR复合扩增检验 毛细管电泳荧光检测法 1 范围 本文件规定了通过复合扩增和荧光检测对家猪进行个体识别和亲子鉴定的检验原理、 仪 器试剂、操作方法、结果判读和检验中的注意事项。 本文件适用于家猪基因组 DNA的STR分型检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GA/T 382 -2014法庭科学 DNA实验室建设规 范 GA/T 383 -2014法庭科学 DNA实验室检验规范 GA/T 1161 -2014 法庭科学 DNA检验鉴定文书内容及格式 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 短串联重复序列（ STR） short tandem repeats 重复单位 由2个到6个核苷酸构成，重复次数 5～60多次的DNA片段，总长度多在 400bp以 下的DNA序列。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction, PCR 一种体外扩增特异性 DNA片段的技术 ，可在数小时内获得近百万 个目的DNA片段的拷贝。 3.3 引物 primer 人工合成的寡核苷酸序列，与目的片段两侧翼的序列互补，限定了 PCR产物的长度和特 异性。 3.4 阳性对照 positive control 在实验设置中已知分型的 DNA样本，主要用于监测 DNA分型结果的可靠性和准确性 。 3.5 阴性对照 negative control 在实验中设置的 不含DNA样品的检验样本 。 GA/T XXXX —XXXX 3 4 原理 家猪属于猪科、猪属的多胎高产哺乳动物 ，其STR基因座遗传方式符合孟德尔遗传定律， 可以联合应用多个 STR基因座对其进行 个体识别和亲子鉴定。 5 主要仪器设备 主要仪器设备包括： a) 漩涡振荡器； b) 水浴或干浴； c) 台式离心机； d) 扩增仪； e) 超净工作台； f) 遗传分析仪； g) 移液器。 6 主要试剂 主要试剂包括： a) 去离子水； b) PCR buffer ； c) 热启动Taq DNA聚合酶； d) 氯化镁（ MgCl 2）溶液； e) 脱氧核糖核苷三磷酸（ dNTPs）； f) PCR扩增引物可参考表 1合成： 表1 家猪STR检验基因座名称和引物信息 基因座名称 染色体 引物序列（ 5’-3’） 等位基因范围 分子量大小 （bp） SW240 2p AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA 14～23 88～106 PigSTR13E 13p GTTAGTTTCAGGTAAACAGCAGAGTG AATCCAAACTTCGTGTGCTGTC 13～18.3 125～148 PigSTR15A 15p TGGTGTTGGTTTGATCCTCA TCGGATTCTTTTCCCACCTA 11～20 185～221 S0655 7p GTTGCTGTGTTGTAGGCTGGCAG TGGGGATGGGAGGGAGAGAATT 5～22 263～331 PigSTR11B 11q CCATAGTTACTTCAACCCTAG CCACATTGGTTATCTAGATGG 5～17 83～131 PigSTR14A 14p TGTTGCTGCTATGGGAATTG AAACCCTGCTTCTTTGGAGACAG 8～14 166～190 387A12F 12p TTACAGATGCCCAAGGTGAG GTATACCTGAATCG CTTTGCTG 9～21 208～256 PigSTR4C 4p GCCTCATGTAGCCTTATAAAATCC GATCTAGCACACTCGGGTTCTT 4～9 104～124 PigSTR17A 17p TAAACTCATCATTAAATCCCCTGT GTAGTTTGTGAAAAGAGGCAGG 5～9 151～167 GA/T XXXX —XXXX 4 基因座名称 染色体 引物序列（ 5’-3’） 等位基因范围 分子量大小 （bp） PigSTR5C 5p GGTGGTTGGAGAGACCAGAA GAGCAGTGCCAGGAAGGTAG 5～14 237～273 PigSTR7B 7q TGCGGTTCCTGTTAACCCCA CGTGCTTGCTCCATTAGTATCT 4～12 87～119 S0386 11q AACAGTATTTGCATAGTCAGGC ATGGTTCCTAAGTGGATTCGTT 14～25 188～210 Amel X,Y GCAGGATCGGTCTGTTTTTC ATGCAAGCCCTCCGAGAA —— 232～234 g) 分子量内标； h) 去离子甲酰胺； i) 已知家猪 DNA（阳性对照）。 7 实验室环境要求 符合GA/T 382 -2014中第5章的要求。 8 操作步骤 8.1 家猪STR基因座的选择 共选择了 12个STR基因座，基因座名称及引物序列见表 1。选用多态性较好的 STR基因座 进行PCR扩增，筛选 STR基因座宜参照如下条件： a）已有基因座定义和其特征的文献报道； b）已实施种属特异性、灵敏性、稳定性研究； c）尽量选择串联重复单位为三、四或五核苷酸的基因座。 8.2 扩增反应 8.2.1 准备待扩增样本并编号，样本 DNA提取方法见 GA/T 383 -2014中5.8和5.11。 8.2.2 样本DNA定量方法参照 GA/T383-2014中6.1～6.3的方法执行。 8.2.3 取出冻藏的扩增试剂置于室温解冻，轻弹混匀，离心。 8.2.4 各基因座可逐一扩增，也可配制成引物混合物，在复合扩增体系中一次性扩增。 8.2.5 选择适当的 PCR反应体系进行扩增，推荐 10µL体系。可参照表 2配制PCR反应体系。 表2 PCR体系中各参数用量 试剂 终浓度 2×PCR Buffer 1×PCR Buffer dNTPs 0.2mmol/L MgCl 2 1.6mmol/L PCR引物 0.07～0.3μmol/L GA/T XXXX —XXXX 5 热启动Taq DNA聚合酶 0.3U/μL 纯水 — 模板DNA — 注：DNA模板量过大， 会出现非特异扩增带和片段间峰高不平衡等现象， DNA模板量应控制在 0.1ng～ 1.0ng。 8.2.6 选择适当的 PCR扩增条件进行扩增。可参照表 3设置扩增条件参数。 表3 PCR反应条件 反应温度 反应时间 循环数 95℃ 11min 1 94℃ 1min 28 61℃ 1min 72℃ 1min 60℃ 60min 1 25℃ ∞ - 8.2.7 扩增完毕后应立即检测或将产物置于 4℃保存。 8.3 检测分析 8.3.1 光谱校正：在 1.5mL离心管中加入 250µL甲酰胺与 6µL荧光标准品，混匀， 95℃变性5 min ，冰浴 3min，在96孔板中分装后放到遗传分析仪中，选择合适的参数。如果校正结果 能够达到仪器所要求的参数范围，则实验通过。标准品测试结果要求 Q值>0.95。 8.3.2 按照适当比例混合分子量内标和去离子甲酰胺，配制成检