ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T XXXX—XXXX 法庭科学 大麻性别基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 Forensic Science - The detection of cannabis sativa L sex -determining gene fragment Capillary -electrophoresis and fluorescence method （报批稿） ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T XXXX—XXXX I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会（ SAC/TC 179 ）提出并归口。 本文件起草单位：公安部物证鉴定中心、最高人民检察院检察技术信息研究中心、毕节市公安局。 本文件主要起草人：裴黎、徐小玉、凃政、彭建雄、张颖、牛慧媛、马原、张贵芹、冯涛、郭佳、 董林芳、孔铭华、李元元、祝世敬。 GA/T XXXX—XXXX 1 法庭科学 大麻性别基因特异片段检测 毛细管电泳荧光检测法 1 范围 本文件规定了法庭科学 DNA实验室通过 PCR复合扩增、毛细管电泳荧光检测鉴别大麻性别的材料准 备、操作方法和结果判定。 本文件适用于除大麻种籽外大麻植物及其相关制品的性染色体类型的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GA/T 382-2014 法庭科学 DNA实验室建设规范 GA/T 1160 -2014 常见毒品原植物的 DNA提取方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 性染色体 sex chromosome 与决定性别相关的染色体，包括 X染色体和 Y染色体。 3.2 阳性对照 positive control 在PCR系统中加入已知分型的模板 DNA进行的对照反应。本文件中指加入已知雌性、雄性大麻样 本DNA模板的扩增反应。 3.3 阴性对照 negative control 不含模板 DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对照反应。 4 器材 器材包括： a) 移液器； b) 台式离心机； c) 扩增仪； GA/T XXXX—XXXX 2 d) 全自动荧光分析仪。 5 试剂 试剂包括： a) 纯水； b) PCR扩增引物： ·引物对1（X染色体）： （F）5’ FAM-AGCCTGTCTAAGAGTGGG3 ’ （R）5’ACGTTGTTGCTCGTAAAT3 ’ ·引物对2（Y染色体） ： （F）5’FAM-GCCCAAGTTGCTGCTGAG3 ’ （R）5’CCCACCGTTTAGGGAGCA3 ’ c) PCR缓冲液； d) 热启动Taq DNA聚合酶； e) 氯化镁（ MgCl 2）溶液； f) 脱氧核糖核苷三磷酸（ dNTPs）； g) 分子量内标； h) 去离子甲酰胺； i) 已知雌、雄性大麻 DNA（阳性对照） 。 6 实验室环境要求 符合 GA/T 382 -2014中第5章的要求。 7 操作步骤 7.1 扩增反应 7.1.1 准备待扩增样品并编号，检材 DNA提取方法见 GA/T 1160 -2014。 7.1.2 取出冷藏的扩增试剂使其温度达到室温，轻弹混匀，离心。 7.1.3 选择适当的扩增反应体系进行扩增。可参照表 1计算反应用量，配置扩增反应体系。 表1 大麻性别基因特异片段 PCR反应体系 试剂 用量 μL 终浓度 10×PCR Buffer 2.5 — dNTPs(2.5mmol/L) 2.0 0.2 mmol/L MgCl 2(25mmol/L) 2.0 2 mmol/L 引物对1 (5μmol/L) 上、下游各 0.85 0.17 μmol/L 引物对2 (5μmol/L) 上、下游各 1.0 0.2 μmol/L 热启动Taq DNA 聚合酶（ 5U/μL） 0.2 0.04 U/μL 纯水 13.6 — GA/T XXXX—XXXX 3 表1 （续） 试剂 用量 μL 终浓度 模板DNA 1.0 — 注： DNA模板量过大，会出现非特异扩增带和片段间峰高不平衡等现象， DNA模板量应 控制在0.5ng～1ng。 7.1.4 按照计算结果混合各种成分，混匀、离心，分装到反应管内。 7.1.5 选择适当的扩增条件进行扩增。可参照表 2设置循环参数。 表2 大麻性别基因特异片段扩增条件 温度(℃) 时间 循环数 95 11min 1 94 30s 30 60 30s 72 1min 72 2min 1 4 - - 7.1.6 将反应管放入扩增仪中，按照设定的程序运行 。 7.1.7 扩增完毕后将产物置于 4℃保存。如果保存时间大于 2周，应置于 -15℃～-20℃保存。 7.2 检测分析 7.2.1 按适当比例混合分子量内标和 去离子甲酰胺， 配制成上样混合 物，振荡混合均匀。 7.2.2 向每个检测孔中加入 10μL上样混合物和 1μL扩增产物，快速离心，去除气泡。 7.2.3 详细的电泳步骤参见全自动荧光分析仪操作手册 。 7.2.4 电泳完毕后，经数据分析软件分析后得到各产物的片段长度。详细分析步骤参见分析 软件操作 手册。 8 结果判断 当电泳分析结果在带 1处检出荧光峰则说明该检测样本含有 X染色体；当在带 2处检出荧光峰则说明 该检测样本含有 Y染色体。大麻雄性和雌性样本检测结果详见图 1。不同条件下检测特异性片段大小可 能有差异，本文件 中所列分型数据为使用 Applied Biosystems 3500xL型遗传分析仪、 GeneScanTM 600 LizTM分子量内标、 GeneMapperTMID-X软件分析的结果（系统误差± 0.5bp），若使用其他型号器材、试 剂、软件检测，请注意随机误差与系统误差。当检测条件不同或使用其他型号仪器时可能会出现碱基 数的偏差，应以同批次检测的阳性对照结果为参考综合判断。 GA/T XXXX—XXXX 4 a) X分型（大麻雌性植株） b) X/Y分型（大麻雄性植株） 图1 大麻雌性和雄性样本检测结果 9 注意事项 9.1 本文件规定的方法不适用于大麻种籽类检材的性染色体类型的检验。 9.2 有效检测信号峰值应大于 150RFU（RFU：相对荧光单位）。当检测信号峰值超过仪器检测最高阈 值时，应重新检验。 9.3 检验鉴定中应同时检验已知雌性、雄性大麻 DNA的阳性对照和扩增试剂的阴性对照。阳性对照和 阴性对照均正确时，检验结果判定才有效。 9.4 阳性对照样本使用已知雌、雄性大麻成熟植株提取 DNA制作而成。 _________________________________