ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T ××××—×××× 法庭科学 生物检材 中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙 检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination m ethods for oleandrin and adynerin in biological samples —LC-MS ×××× -××－××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和 国公安部 发 布 GA/T × × × × —× × × × 1 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别 专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 (SAC/TC 179/SC1) 提出并归口。 本文件起草单位： 公安部物证鉴定中心 、杭州市公安司法鉴定中心 、中国人民公安大学 。 本文件主要起草人： 王芳琳、栾玉静、姚伊人、应剑波、何洪源。 GA/T × × × × —× × × × 2 法庭科学 生物检材 中夹竹桃苷和夹竹桃苷乙 检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学 领域生物检材（血液、尿液）中夹竹桃苷 、夹竹桃苷乙 的液相色谱 -质谱 （LC-MS）检验方法。 本文件适用于法庭科学 领域生物检材（血液、尿液） 中夹竹桃苷 、夹竹桃苷乙 的定性分析和定量 分析。其他 检材可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有 的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求， 对生物检材进行 提取、净化及浓缩， 采用液相 色谱 -串联质谱法检测，以保留时间、 质谱特征离 子对和离子对丰度比作为定性判断依据； 以峰面积为 依据，采用外标法 进行定量分析。 5 试剂及材料 5.1 试剂 实验用水应符 合GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用 的试剂均为色谱纯，试 剂包括： a) 乙腈； b) 甲醇； c) 甲酸； d) 甲酸铵； e) 磷酸盐缓冲 液（ pH值6.0） ：称取磷酸二氢钠（分析纯） 8.34g、磷酸氢二钠 （分析纯） 0.87g， 于1000mL容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度； f) 10mmoL/L 甲酸铵溶液 （含0.1%甲酸）：称取甲酸铵 0.62g，加水溶解后，再加入 100µ L甲酸， 用水稀释至 1000mL； g) 标准物质溶液： GA/T × × × × —× × × × 3 1) 1.0mg/mL 标准物质 储备液：根据夹竹桃苷 和夹竹桃苷乙 标准物质的纯度 ，称取适量，用 甲醇分别配制成1.0mg/mL 夹竹桃苷 、夹竹桃苷乙 标准物质 储备液，密封， 0℃~4℃保存， 有效期 6个月。或采用市售标准溶液； 2) 10.0µg/mL单一标准物质 工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质储备 液，用甲醇配制成浓度 为10.0µg/mL的单一标准工作 溶液，密封， 0℃~4℃保存，有效期 3个月。实验中所用其 他浓度的单一标准工作溶液均由 10.0µg/mL单一标准物质 工作溶液配制得到； 3) 0.1mg/mL混合标准物质 工作溶液：分别移取 1.0mg/mL 的夹竹桃苷 、夹竹桃苷乙 标准物 质储备溶液 ，用甲醇配制成浓度为 0.1mg/mL的混合标准物质工作 溶液，密封， 0℃~4℃ 保存，有效期 3个月。实验中所用其他浓度的 混合标准物质工作溶液均由 0.1mg/mL混合 标准物质 工作溶液配制得到。 5.2 材料 材料包括： a) 一次性注射器 ； b) 液液支撑固相 萃取柱：ISOLUTE SLE+ 液液支撑固相 萃取柱； 注： ISOLUTE SLE+ 液液支撑固相萃取柱 是Biotage公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用 者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 c) 具盖离心管 ； d) 有机系微孔滤膜： 0.22µ m。 6 仪器和设备 仪器和设备 包括： a) 液相色谱 -质谱仪，配有电喷雾离子 源（ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 电子天平 ：分度值 d≤0.01mg； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器； f) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL于具盖离心管中 ， 加入乙酸乙酯 5mL，振荡 10min，不低于 8000r/min 离心 10min，分离有机相； 重复提取一次，合并两次提取的有机相 ，置于浓缩器上 40℃下浓缩至干 ， 残留物用初始流动相 0.5mL溶解，经0.22µ m有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液，供仪器 检测。 注：检材样品取 样量、提取溶剂体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 液液支撑固相萃取 移取血液 等液体检材样品 0.5mL于具塞试管中 ，加入磷酸盐缓冲液 0.5mL，混匀，将样品加入液液GA/T × × × × —× × × × 4 支撑固相 萃取柱中 ，用正压将 样品压入柱中， 静置 5min，乙酸乙酯 8mL分两次加入到萃取柱中， 流速 控制为0.5mL/min ～1.0mL/min ；再将柱中残余的液体挤出 。收集流出液，置于浓缩器上 40℃下浓缩至 干，残留物用初始流动相 0.5mL溶解，经0.22µ m有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液，供仪器 检测。 注：检材样品取样量 和定容体积 可根据实 际情况调整。 7.1.1.3质控样品制备 取等量相似基质的空白样品 （若无相似基质空白 样品可用血液替代） 两份于具盖离心管中 ，一份作 为空白样品 ，一份添加标准物质工作溶液 ，使夹竹桃苷 、夹竹桃苷乙 浓度为20ng/mL，作为添加样品 ， 与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 ，供仪器检测。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： kinetex C 18 (3.0mm× 50mm ，2.6µ m）； 注： kinetex C 18色谱柱是Phenomenex 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是 表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温： 40℃； c) 流动相 A：乙腈； d) 流动相 B： 10mmoL/L 甲酸铵溶液（含0.1%甲酸）； e) 流速： 0.5mL/min； f) 进样体积： 10μL； g) 洗脱：梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1； 表1 流动相和梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 0～0.2 10% 90% 3.0 95% 5% 5.0 95% 5% 5.1 10% 90% 7.0 10% 90% h) 扫描方式：正离子扫描 (ESI+)； i) 检测方式：多反应监测 (MRM)； j) 离子源温度： 550℃； k) 雾化气压力 ：55psi； l) 电喷雾电压： 5500V； m) 气帘气压力： 35psi； n) 辅助气压力： 55psi； o) 定性、定量离子对和 去簇电压、碰撞能量条件见表 2。 GA/T × × × × —× × × × 5 表2 定性、定量离子对和 去簇电压、碰撞能量条件 目标物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 夹竹桃苷 577.5> 373.3 577.5> 373.3 105 19 577.5 >43 3.3 105 13 夹竹桃苷乙 534.4 >373.3 534.4 >373.3 26 15 534.4 > 113.2 20 18 7.1.2.2 进样 分别吸取 空白溶剂、添加样品 提取液、空白样品 提取液、检材样品 提取液、标准物质工作溶液， 按 7.1.2.1仪器条件 进行检测。进样顺序和进样次数应确保结果有效。 7.2 定量分析 7.2.1样品前处理 移取血液等液体 检材样品 1.0mL两份，按7.1.1进行操作 ，得到空白样品提取液 ，供仪器检测 。 取与检材样品等量的相似基质空白样品， 与检材样品平行操 作， 得到空白样品提取液 ， 供仪器检测 。 取与检材样品等量的相似基质空白样品