ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T ×××× —×××× 法庭科学 生物检材中钩吻素甲和钩吻 素子检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for gelsemine and koumine in biological samples —LC-MS ×××× -××－××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发 布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （ SAC/TC 179/SC 1 ） 提出并归口。 本文件起草单位：公安部物证鉴定中心、 济南市公安局刑事科学技术研究所 、云南省公安厅 、柳州 市公安局物证鉴定所 。 本文件主要起草人： 栾玉静、王芳琳、 王爱华、 武继锋、宋蕊 、李虹、臧源云、李军 。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中 钩吻素甲和钩吻素子 检验 液相色谱-质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学 领域生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容） 中钩吻素甲和钩吻素子的液 相色谱 -质谱（ LC-MS）检验方法 。 本文件适用于法庭科学领域生物检材（血、尿、肝、肾、胃及胃内容） 中钩吻素甲和钩吻素子 的定 性分析和定量分析。其他 检材可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求， 对生物检材进行 提取、净化及浓缩， 采用液相 色谱-质谱法检测，以保留时间、质谱特征 离子对和离子对丰度比作为定性判断依据； 以色谱峰面积作 为定量依据，采用外标 -单点法进行定量分析。 5 试剂、仪器与材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为 色谱纯，试 剂包括： a) 甲醇； b) 乙腈； c) 甲酸铵； d) 甲酸； e) 乙酸乙酯 ； f) 1%氢氧化钠 溶液：称称氢氧化钠 1.0g，加入一定量的水溶解并稀释至 100mL； g) 磷酸盐缓冲液（ pH值6）：称取磷酸二氢钠 （分析纯） 8.34g与磷酸氢二钠 （分析纯） 0.87g,， 分别置于 1000mL容量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度； GA/T× × × × —× × × × 2 h) 含0.1%甲酸的 10mmoL/ L醋酸铵溶液： 称取醋酸铵 0.384g，加入一定量的水溶解， 并加入 0.5mL 甲酸混匀， 加水稀释至 500mL； i) 标准溶液： 1） 1.0mg/mL 单一标准物质 储备液：根据钩吻素甲和钩吻素子标准物质的纯度，分别用甲醇 配制 1.0mg/mL 钩吻素甲和钩吻素子 单一标准物质 储备液，密封， -18℃以下保存，有效 期12个月。或采用市售单一标准溶液； 2） 0.1mg/mL 混合标准物质工作溶 液：移取 1.0mg/mL 的钩吻素甲和钩吻素子单一标准物质 储备液，用甲醇配制成浓度为 0.1mg/mL 的混合标准物质工作溶液，密封， 0℃~4℃保存， 有效期 3个月。实验中所用其 他浓度的混合标准 物质工作溶液均由 0.1mg/mL 混合标准 物 质工作溶液用甲醇稀释得到； 3） 10.0µ g/mL 单一标准 物质工作溶液 ：移取 1.0mg/mL 的钩吻素甲和钩吻素子 标准物质 储备 液，分别用甲醇配制成 1.0µ g/m L单一标准物质工作溶液，密封， 0℃~4℃保存，有效期 3 个月。实验中所用其 他浓度的单一标准 物质工作溶液均由 10.0µ g /mL单一标准物质 工作溶 液用甲醇稀释得到。 5.2 材料 材料包括： a） 具盖离心管 ； b） 具塞玻璃试管 ； c） 固相萃取柱： Oasis® HLB固相萃取柱 或等效固相萃取柱； 注： Oasis® HLB 柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 d） 一次性注射器 ； e）有机系微孔滤膜： 0.22µ m。 6 仪器和设备 仪器和设备 包括： a) 液相色谱 -质谱仪，配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 电子天平： 实际分度值 d≤0.01mg； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器； f) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g于具盖离心管中，加 入 一定量的氢氧化钠溶液调 pH值（9～10），再加入 5mL乙酸乙酯，振荡 10min，不低于 8000r/min 离心GA/T× × × × —× × × × 3 10min，分离有机相 ，重复提取一次，合并两次 提取的有机相， 置于浓缩器上 50℃浓缩至干，残留物用 甲醇 0.1mL溶解，经0.22μm的有机系微孔滤膜过滤 ，作为检材样品提取液，供仪器检测。 注：检材样品取样量、提取溶剂体积及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g于具盖离心管中， 加入 pH 值6磷酸盐缓冲液 3mL，混匀，超声 15min，不低于 8000r/min 离心 20min，取上清液 转移至固相萃取柱中 （使用前依次用甲醇 3mL、水3mL活化）， 控制上清液过柱流速 0.5mL/min ～1.0mL/min ， 再依次用水 3mL、 甲醇 /水（体积比 5:95）3mL淋洗，抽干弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用甲醇 2mL洗脱，收集洗脱液并置于浓缩器上 50℃浓缩至干，残留物用 500µ L初始流动相溶解， 经0.22μm的有 机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液 ，供仪器分析。 注：检材样品取样量、缓冲液体积、洗脱液体积及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 钩吻素甲和钩吻素子 标准物质， 使其浓度为 20ng/mL（g），作为添加样品 ，与检 材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 ，供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 液相色谱 -质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： Kinetex C 18（3.0mm× 50mm ，2.6µ m）柱或等效色谱柱； 注： Kinetex C 18柱为 Phenomenex 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对 该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 b) 流动相： A：含0.1%甲酸的 10mmoL/L 甲酸铵溶液， B：甲醇； c) 流速： 0.5mL/min； d) 洗脱方式：梯度洗脱，梯度见表 1； 表1梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 0.2 95% 5% 3.0 5% 95% 4.0 5% 95% 5.1 95% 5% 7.0 95% 5% e) 进样量： 1µL～10µL； f) 扫描方式：正离子扫描 （ESI+）； g) 检测方式：多反应监测 （MRM）； h) 电喷雾电压： 5500V； GA/T× × × × —× × × × 4 i) 离子源温度： 650℃； j) 雾化气压力： 55psi； k) 气帘气压力： 50psi； l) 辅助气压力： 50psi； m) 定性定量 离子对、去簇电压、碰撞能 量见表 2。 表2 定性定量离子对、去簇电压、碰撞能量 目标物 定量离子对 m/z 定性离子对 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 钩吻素甲 323.2> 236.1 323.2> 236.1 100 36 323.2 > 195.2 130 50 钩吻素子 307.2> 180.2 307.2> 180.2 120 60 307.2> 167.0 130 67