ICS 13.310 CCS A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中雷 公藤内酯甲等 4 种雷公藤毒素检验 液相色谱 -质谱法 Forensic s ciences—Examination m ethods for 4 tripterygium toxin including wilforlide A in biological samples —LC-MS/MS ×××× -××－××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别 专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC1 ）提出并归口。 本文件起草单位：公安部物证鉴定中心、 杭州市公安司法鉴定中心 、广西省公安厅、云南省公安厅 。 本文件主要起草人：王芳琳、栾玉静、应剑波 、黄克建、李虹 。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中雷公藤内酯甲等 4种雷公藤毒素检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾、胃及胃内容） 中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、 雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱 -质谱（LC-MS/MS）检验方法 。 本文件适用于法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾、胃及胃内容） 中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯 酮、雷公藤甲素和雷公藤红素 的定性分析和定量分析。其他检材可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适 用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求， 对生物检材进行 提取、净化及浓缩， 采用液相 色谱-质谱法检测，以保留时间、质谱特征离子 对和离子对丰度比作为定性判断依据； 以峰面积为依据， 采用外标法 进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级 水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试 剂包括： a) 甲醇（色谱纯） ； b) 乙腈（色谱纯） ； c) 乙酸乙酯； d) 1%氢氧化钠 溶液：称取氢氧化钠 1.0g，加入一定量的水溶解并稀释至 100mL； e) 磷酸盐缓冲液（ pH值6.0）：分别称取磷酸二氢钠 8.34g、磷酸氢二钠 0.87g，加入一定量的水 溶解并稀释至 1000mL。 GA/T× × × × —× × × × 2 f) 10mmoL /L醋酸铵溶液（含0.1%甲酸）：称取醋酸铵 0.384g，加入一定量的水溶解，并加入 0.5mL甲酸混匀 ，加水稀释至 500mL； g) 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质 储备液：根据雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红 素标准物质的纯度，分别用甲醇配制 1.0mg/mL 雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲 素和雷公藤红素 标准物质溶液， 密封， 0℃~4℃保存，有效期 6个月。或采用市售标准溶 液； 2) 0.1mg/mL 混合标准 物质工作溶液： 分别移取 1.0mg/mL 的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、 雷公藤甲素和雷公藤红素标准物质溶液各 1.0mL，用甲醇配制成浓度为 0.1m g/mL的混合 标准物质工作溶液 ，密封， 0℃~4℃保存，有效期 3个月。实验中所用 其他浓度的混合标 准工作溶液均由 0.1mg/mL 混合标准工作溶液 配制得到； 3) 10.0µg/mL单一标准物质 工作溶液：分别移取 1.0mg/mL 的雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、 雷公藤甲素和雷公藤红素 标准物质 储备液，用甲醇配制成浓度为 10.0µg/mL的单一标准工 作溶液，密封， 0℃~4℃保存，有效期 3个月。实验中所用其他浓度的单一标准 物质工作 溶液均由 10.0µg/mL单一标准物质 工作溶液配制得到。 5.2 材料 材料包括： a) 固相萃取柱： Oasis® HLB固相萃取柱或其他等效固相萃取柱； 注： Oasis® HLB 柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产 品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 有机系微孔滤膜： 0.22µ m； c) 一次性注射器； d) 具盖离心管。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 电子天平： 分度值 d≤0.01mg； c) 离心机； d) 超声波清洗器； e) 振荡器； e) 移液器； f) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等 液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等 固体检材样品 1.0g于具盖离心管中 ，加入GA/T× × × × —× × × × 3 氢氧化钠溶液调 pH值9~pH值10，再加入乙酸乙酯 5mL，振荡 10min，不低于 8000r/min 离心 10min， 分离有机相 ；重复提取一次 ，合并两次提取的有机相 ，置于浓缩器上 50℃下浓缩至干 ，残留物用初始 流动相 0.5mL溶解，经0.22µ m有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液 ，供仪器检测。 注：检材样品取样量、提取溶剂体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎的肝脏等固 体检材样品 1.0g于具盖离心管中， 加入 磷酸盐缓冲液 4mL，混匀，超声 15min，不低于 8000r/min 离心 20min，取上清液转移至已活化 好（依 次用甲醇 3mL、水 3mL活化）的固相萃取柱中，控制上清液过柱流速 低于 1.0mL/min，依次用水 3mL、 甲醇 /水（体积比 5:95）3mL淋洗，弃去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽固相萃取柱 2min，用 4mL 甲醇洗脱，收集洗脱液并 置于浓缩器上 50℃下浓缩至干，残留物用初始流动相 0.5mL溶解，经 0.22µ m 有机系微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液，供仪器检测 。 注：检材样品取样量可根据实际情况调整。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 标准物质工作溶液 ，使雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素 浓度为 20ng/mL（g），作为添加样品 ，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 液相色谱 -串联质谱 仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱： Kinetex C18(3.0mm× 50mm ，2.6µ m )柱或等效色谱柱； 注： Kinetex C 18柱为 Phenomenex 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示 对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温箱： 40℃； c) 流动相 A：10mmoL /L醋酸铵溶液 （含 0.1%甲酸）； d) 流动相 B：甲醇； e) 流速： 0.5mL/min ； f) 进样体积： 10μL； g) 洗脱方式：梯度洗脱， 梯度洗脱条件见表 1； 表1梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 0～0.2 95% 5% 3.0 5% 95% 4.0 5% 95% 5.1 95% 5% 7.0 95% 5% h) 扫描方式：正离子扫描 (ESI+)； GA/T× × × × —× × × × 4 i) 检测方式：多反应监测 (MRM)； j) 电喷雾电压： 5500V； k) 离子源温度： 650℃； l) 雾化气压力： 55psi； m) 气帘气压力： 50psi； n) 辅助气压力： 50psi； o) 定性、定量离子对和 去簇电压、碰撞能量条件见表 2。 表2 定性、定量离子对和 去簇电压、碰撞能量条件 目标物 定量离子 m/z 定性离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 雷公藤甲素 361.2 > 145.0 361.2 > 145.0 147 35