HHP GA/T ××××—× × × × ICS 13.310 CCS A 92 中华人民共和国公共安全行业标准 GA 法庭科学 生物检材中溴敌隆等 14种 抗凝血鼠药检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for 14 anticogulant rodenticides including bromadiolone in biological samples —LC-MS ×××× -××-××发布 ×××× -××-××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （SAC/TC 179/SC 1 ）提出并归口。 本文件起草单位： 湖北省公安厅刑事侦查总队、 公安部物证鉴定中心、广西壮族自治区公安厅刑事 侦查总队、广东省公安厅刑事技术中心、广州市公安局刑事技术所、重庆市公安局物证鉴定中心、杭州 市公安局刑事科学技术研究所、 中国刑事警察学院、 淄博市公安司法鉴定中心、 黄石市公安局刑侦支队 。 本文件主要起草 人：吕纪忠、张银华、孙杰燕、陈祥国、于忠山、魏春明、 王爱华、 刘晓锋、裴茂 清、张亮、戴维列、孙立敏、石银涛、段杰、应剑波、朱昱、陈学国、李鹏、高吭。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中溴敌隆等 14种抗凝血 鼠药检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学生物检材 （血液、尿液 ）中14种抗凝血鼠药的液相色谱 -质谱（ LC-MS）检 验方法。 本文件适用于法庭科学生物检材 （血液、尿液 ）中14种抗凝血鼠药的定性分析和定量分析。 其他检 材可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求， 对生物检材 中14种抗凝血鼠药 （详见附录 A） 进行提取后 ，采用液相色谱 -三重四极杆串联质谱或液相色谱 -高分辨质谱检测， 用外标法进行定量 。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为色谱纯，试 剂包括： a) 乙腈； b) 甲醇； c) 甲酸铵； d) 5mmol/L 甲酸铵溶液：称取甲酸铵 0.315g，加水溶解稀释至 1000mL。 e) 标准溶液： 1） 0.1mg/mL 单一标准物质储备溶液：根据 14种抗凝血鼠药 标准物质 纯度和盐型换算后， 各称取适量，用甲醇 分别配制成 0.1mg/mL单一标准物质储备溶液， 混匀，密封， -18℃ 以下保存，有效期 12个月。或采用市售 单一标准溶液； 2） 单一标准物质 工作溶液：移取 0.1mg/mL 的14种抗凝血鼠药的 单一标准物质储备溶液 ， 用甲醇分别配制成 1.0µg/mL单一标准物质工作溶液，密封， 0℃~4℃保存，有效期 6个GA/T× × × × —× × × × 2 月。实验中所用 其它浓度的单一标准工作溶液 ，均由 0.1mg/mL 单一标准物质储备溶液 用甲醇稀释得到； 3） 混合标准物质工作 溶液：分别移取 0.1mg/mL 的14种抗凝血鼠药的 单一标准物质储备溶 液，用甲醇配制成浓度 分别为500.0 ng/mL、250.0 ng/mL、125.0 ng/mL、50.0ng/mL、 25.0ng/mL的混合标准物质工作 溶液，密封， 0℃~4℃保存，有效期 3个月；实验中所用 其它浓度的混合标准物质工作溶液 ，均由单一标准物质 工作溶液用甲醇配制得到； 4） 质控标准溶液： 分别移取杀鼠灵、噻鼠灵 和敌鼠的单一标准物质储备溶液 ，用甲醇配制 成浓度为 1.0µg/mL的质控标准溶液 ，密封， 0℃~4℃保存，有效期 3个月。 注：可以根据实际需要选择质控标准溶液中抗凝血鼠药的种类。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管； b) 玻璃试管； c) 量筒； d) 容量瓶； e) 有机微孔滤膜： 0.22µm。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -高分辨质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）； b) 液相色谱 -三重四极杆串联 质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）； c) 振荡器； d) 电子天平： 实际分度值 d≤0.01mg； e) 离心机； f) 移液器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品前处理 7.1.1.1 蛋白沉淀 移取血液等液体 检材样品 0.5mL于具盖离心管中 ，加入乙腈 1.5mL，振荡 5min，不低于 8000r/min 离心 10min，取上清液， 经有机微孔滤膜过滤，作为检材样品提取液， 供仪器检测。 必要时可将滤液挥 干，用等体积初始 流动相溶解。 注：检材样品取样量和乙腈体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 质控标准溶液 ，使其中杀鼠灵、噻鼠灵 和敌鼠的浓度均为10.0ng/mL，作为添加 样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 ，供仪器检测。 注：可根据实际需要选择质控标准溶液中抗凝血鼠药的种类 。 GA/T× × × × —× × × × 3 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 液相色谱 -高分辨质谱仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： Hypersil Gold （2.1mm×100mm , 1.9µm）或其它 C18等效柱； 注： Hypersil Gold 柱为 Therm o公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该 产品的认可。如果 其它等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温： 30℃； c) 流动相：流动相 A：甲醇， 流动相 B：5mmol/L 甲酸铵溶液 ； d) 流速： 0.2mL/min ； e) 洗脱：梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1； 表1 梯度洗脱条件 时间 min 流动相 A 流动相 B 0.0 20% 80% 3.0 20% 80% 14.00 95% 5% 20.00 95% 5% 20.00 20% 80% 25.00 20% 80% f) 扫描方式：负离子 扫描（ Full MS，Target MS2）； g) 采集范围： 50Da～750Da； h) 一级质谱分辨率： 70000； i) 二级质谱分辨率： 17500； j) 喷雾电压： 2.5kV； k) S-lens RF电压： 60V； l) 毛细管为温度： 350℃ m) 鞘气压力：（氮气） 40Arb； n) 辅助气体压力：（氮气） 5Arb； o) 辅助气温度： 105℃； p) 进样量： 5µL； q) 质谱定性、定量离子和归一化碰撞能量 条件见表 2。 GA/T× × × × —× × × × 4 表2 质谱定性离子和 碰撞能量 条件 目标物 定性离子理论精确质 荷比 定量离子理论精确质 荷比 [M-H]- 归一化碰撞能量 eV 二级质谱特征 离子 溴敌隆 525.0707 45 250.0632 525.0707 272.9920 溴鼠灵 521.0758 45 135.0436 521.0758 187.0389 杀鼠灵 307.0976 40 161.0229 307.0976 250.0631 氯灭鼠灵 341.0586 40 284.0239 341.0586 161.0230 鼠得克 443.1653 50 135.0436 443.1653 293.1336 杀鼠醚 291.1027 55 141.0694 291.1027 247.1124 敌鼠灵 335.0561 10 161.0230 335.0561 171.0262 克鼠灵 297.0768 40 161.023