HHP ICS 13.310 CCS A 92 中华人民共 和国公共安全行业标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中乌头碱等 21种 生物碱筛选 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Screening methods for 21 alkaloids including aconitine in biological samples —LC-MS ×××× -××-××发布 ×××× -××-××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别 专利的责任。 本文件由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会 （ SAC/TC 179/SC 1 ）提出并归口。 本文件起草单位： 重庆市公安局物证鉴定中心 、公安部物证鉴定中心、 广西壮族自治区公安厅 、 广州市公安局 、广东省公安厅 、贵州省公安厅 、济南市公安局 、杭州市公安局 。 本文件主要起草人： 王俊伟、石银涛、郑经、李恒、郭璟琦、刘文文、任昕昕、 张云峰、 王爱华、 黄克建、孙立敏、张亮、 王立雄、 武继锋、 汪旭峰、应剑波 。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中 乌头碱等 21种生物碱筛选 液相色谱 -质谱法 1 范围 本文件规定了法庭科学 生物检材 （血液、尿液、肝脏）中乌头碱等21种生物碱的液相色谱 -质谱检 验方法。 本文件适用于法庭科学 生物检材 （血液、尿液、肝脏）中乌头碱等21种生物碱 的定性分析。 其他检 材可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品 作对照，按平行操作的要求， 对生物检材 样品中21种生物碱 （详见附录 A） 进行提取、净化及浓缩， 采用液相色谱 -三重四极杆串联 质谱或液相色 谱-高分辨质谱检测。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应 符合 GB/T 6682 中规定的 一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为 色谱纯，试 剂包括： a） 甲醇； b） 乙腈； c） 甲酸： d） 乙酸乙酯 ； e） pH值6的磷酸盐缓冲液 （以配制 100mL为例）：称取磷酸氢二钠（ Na2HPO 4· 12H 2O）0.88g， 磷酸二氢钠（ NaH 2PO 4· 2H 2O）2.74g，加水溶解定容至 100mL，摇匀备用 ； f） 含5× 10-3mol/L甲酸铵和 0.1％甲酸的水溶液 （以配制 100mL为例）：取 0.032g甲酸铵和 100µ L 甲酸，加水溶解定容至 100mL，摇匀备用 ； g） 流动相：含 5× 10-3moL /L甲酸铵和 0.1％甲酸的水溶液 为流动相 A，乙腈为 流动相 B； h） 初始流动相： 分别量取流动相 A 900mL，流动相 B 100mL，混合均匀； i） 标准溶液： GA/T× × × × —× × × × 2 1) 1.0mg/mL 标准储备溶液：根据 21种生物碱的 纯度和盐型换算后，分别用 乙腈配制 21种 生物碱 1.0mg/mL 标准储备溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 6个月。或采用市 售标准溶液 ； 2) 单一标准工作溶液：准确移取 21种生物碱 1.0mg/mL 标准储备溶液各 10µ L，用乙腈定容 至1.0mL，混匀，密封， 配制成0.01mg/mL 的单一标准工作溶液， 置于冰箱中冷藏保存， 有效期 3个月；实验中所用 其他浓度的单一标准工作溶液均由 0.01mg/mL 的单一标准工 作溶液稀释得到 ； 3) 混合标准 工作溶液： 根据实验需要配制成相应浓度 （ 5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、 100ng/mL 、200ng/mL 、500ng/mL 、1000ng/mL ）的混合标准工作溶液，现用 现配； 4) 质控标准工 作溶液：根据实验需要配制成相应浓度的 新乌头碱、雷公藤吉碱、青藤碱 混合 标准工作溶液，现用现配。 注：根据实际情 况，可以适当调整质控 标准工作溶液中生物碱的种类。 5.2 材料 材料包括： a） 具盖离心管 ； b） 两相微孔滤膜： 0.22µ m； c） 固相萃取柱 ：Oasis® HLB柱（60mg, 3mL）或等效固相萃取柱。 注：Oasis® HLB柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对 该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a）液相色谱 -三重四极杆串联质谱仪： 配有电喷雾离子源（ ESI）； b）液相色谱 -高分辨质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）和高分辨质量分析器； c）电子天平： 实际分度值 d≤0.1mg； d）振荡器； e）超声波清洗器； f）浓缩器； g）均质器； h）离心机； i）移液器。 7 操作方法 7.1 样品前处理 7.1.1 蛋白沉淀 移取血液等液体检材样品 0.5mL或称取铰碎 或匀浆的肝脏等固体检材样品 0.5g于具盖离心管中。 加入 1.5mL乙腈，用振荡器振荡 10min，用离心机 以不低于 8000r/min 离心 10min，取上清液 经微孔滤 膜过滤， 作为检材样品提取液 ，供仪器检测。 注：检材样品取样量和乙腈体积可根据实际情况调整。 GA/T× × × × —× × × × 3 7.1.2 液液萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎 或匀浆的肝脏等固体检材样品 1.0g于具盖离心管中。 加入乙酸乙酯 5.0mL，用振荡器振荡 10min，用离心机 以不低于 8000r/min 离心 10min，分离有机相； 上清液于 40℃吹至近干，用 300μL初始流动相定容，涡旋，离心， 经微孔滤膜过滤， 作为检材样品提 取液，供仪器检测。 注：检材样品取样量、 乙酸乙酯 体积及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.3 固相萃取 移取血液等液体检材样品 1.0mL，或称取铰碎 或匀浆的肝脏等固体检材样品 1.0g于具盖离心管中。 加入磷酸盐缓冲液 3mL，用振荡器振荡 10min，用离心机 以不低于 8000r/min 离心 10min，取上清液 待 过柱。取 3mL HLB固相萃取柱 依次以 3mL甲醇、 3mL水活化，将离心后的上清液过柱 ，再以 3mL水 和3mL0.5%甲醇水先 后淋洗，用2mL甲醇洗脱，收集洗脱液 并于 40℃吹至近干，用300μL初始流动相 定容，涡旋，离心 ，经微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液 ，供仪器检测。 注：检材样品取样量、缓冲液体积及定容体积可根 据实际情况调整。 7.1.4 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品 （若无相似基质空白样品可用血液替 代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品， 一份添加质控标准 工作溶液，使 新乌头碱含量为 20ng/mL，雷公藤吉碱 含量为 30ng/mL， 青藤碱含量为 200ng/mL，作为添加样品，与检材样品平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取 液，供仪器检测。 7.2 仪器检测 7.2.1 仪器条件 7.2.1.1 液相色谱 -三重四极 杆串联质谱 仪条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和 不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ACQUITY UPLC@BEH C18 (100mm× 2.1mm ，1.7μm) 或其他等效柱； 注： ACQUITY UPLC@BEH C18是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：35℃； d) 流速： 0.3mL/min ； e) 洗脱：梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1； f) 进样量： 2µ L； g) 扫描方式：正离子扫描； h) 检测方式：多反应监测（ MRM）； i) 电喷雾电压： 5500V； j) 离子源雾化气 ：氮气， 60psi； k) 离子源加热辅助气 ：氮气，55psi； l) 加热器温度 ：550℃； m) 碰撞气： 高纯氮； n) 各生物碱