ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 尿液中地西泮等四种苯骈二氮杂 䓬类药物及其代谢物检验 气相色谱 -质谱 法 Forensic sciences —Examination method s for four benzodiazepines including diazepam and their metabolites in urine samples—GC-MS ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共 和国公安部 发布 GA/T × × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1 ）提出并归口。 本标准起草单位：上海市公安局物证鉴定中心、公安部物证鉴定中心。 本标准主要起草人：汪蓉 、张玉荣、梁晨、于忠山、王芳琳。 GA/T × × × × —× × × × 1 法庭科学 尿液中地西泮等 四种苯骈二氮杂 䓬类药物及其代谢物 检 验 气相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了法庭科学尿液中地西泮 、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑 及其代谢物 N-去甲基地西泮、 替马西泮、 α-羟基三唑仑、 α-羟基阿普唑仑和 α-羟基咪达唑仑 的气相色谱 -质谱（ GC-MS）定性检验方 法。 本标准适用于法庭科学尿液中地西泮 、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑及其代谢物 N-去甲基地西泮、 替马西泮、 α-羟基三唑仑、 α-羟基阿普唑仑和 α-羟基咪达唑仑的定性分析。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期 的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件 。 4 原理 以空白样品作对照，地西泮 -D5或多沙普仑为内标，经液液萃取或固相萃取 对尿液样品进行提取、 净化并浓缩，或衍生化 后，采用气相色谱 -质谱法检测，以保留时间、质谱特征碎片离子峰和相对丰度 比作为定性判断依据。 5 试剂及材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水，在分析 中使用的试剂均为分析纯，试剂包括： a） 甲醇； b） 苯； c） 乙酸乙酯； d） 二氯甲烷； e） 氨水； f） 吡啶； g） 醋酸酐； h） 碳酸钠 /碳酸氢钠（体积比为 3:1）缓冲液（ pH值10.7）：称取碳酸钠 10.6g溶于 100mL水中，配 成1.0mol/L碳酸钠溶液；另称取 8.4g碳酸氢钠溶于 100mL水中，配成 1.0mol/L碳酸氢钠溶液； i） β-葡萄糖醛酸苷酶； GA/T × × × × —× × × × 2 j） 标准溶液： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据地西泮、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑标准物质纯度和盐 型换算后，各称取适量，用甲醇配制 1.0mg/mL 地西泮、三唑仑、阿普唑仑、咪达唑仑标 准物质溶液，密封，置于冰箱中 2℃～8℃保存。有效期 12个月。或采用市售标准溶液； 2) 0.1 mg/mL 标准工作溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质溶液各 1.0mL，用甲醇稀释至 10mL，混 匀，配制成浓度为 0.1 mg/mL 的标准工作溶液。密封，置于冰箱中 2℃～8℃保存，有效期 6 个月；实验中所用其他浓度的标准工作溶液均由 0.1mg/mL 标准工作溶液用甲醇稀释得到； 3) 1.0mg/mL 代谢物标准物质溶液：根据 N-去甲基地西泮、替马西泮、 α-羟基三唑仑、 α-羟 基阿普唑仑和 α-羟基咪达唑仑标准物质纯度和盐型换算后，各称取 适量，用甲醇配制 1.0mg/mLN -去甲基地西泮、替马西泮、 α-羟基三唑仑、 α-羟基阿普唑仑和 α-羟基咪达唑 仑标准物质溶液，密封，置于冰箱中 2℃～8℃保存。有效期 12个月。或采用市售标准溶 液； 4) 0.1mg/mL 代谢物标准物质溶液：移取 1.0mg/mL 标准物质溶液各 1.0mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，配制成浓度为 0.1 mg/mL 的代谢物标准工作溶液。密封，置于冰箱中 2℃ ～8℃保存，有效期 6个月；实验中所用其他浓度的代谢物标准工作溶液均由 0.1mg/mL 标准工作溶液用甲醇稀释得到； 5) 1.0mg/mL 地西泮 -D5（或多沙普仑 ）内标溶液：根据地西泮 -D5（或多沙普仑 ）内标物质纯 度和盐型换算后，称取适量，用甲醇配制 1.0mg/mL 地西泮 -D5（或多沙普仑 ）内标物质溶 液，密封，置于冰箱中 2℃～8℃保存。有效期 12个月。或采用市售标准溶液； 6) 0.1mg/mL 地西泮 -D5（或多沙普仑 ）内标工作溶液： 移取 1.0mg/mL 标准内标溶液各 1.0mL， 用甲醇稀释至 10mL，混匀，配制成浓度为 0.1 mg/mL 的内标工作溶液。密封，置于冰箱 中2℃～8℃保存，有效期 6个月；实验中所用其他浓度的 内标工作溶液均由 0.1mg/mL 内标溶液用甲醇稀释得到 。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括 ： a） 试管及具塞离心管等实验器材； b） pH试纸：范围 1～14； c） 固相萃取柱： Oasis® HLB固相萃取 柱或等效固相萃取柱 ：使用前 依次用甲醇、水 活化。 注： Oasis® HLB柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品 。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a） 气相色谱 -质谱仪：配有电子轰击源（ EI）； b） 电子天平； c） 离心机； d） 振荡器； e） 微波炉； f） 水浴锅； g） 移液器。 GA/T × × × × —× × × × 3 7 操作方法 7.1 样品提取 7.1.1 游离组分的提取 7.1.1.1 液液萃取 移取尿液检材样品 2.0mL于具塞离心试管中，加入内标物 500ng地西泮 -D5（或多沙普仑），再 加 入碳酸钠 /碳酸氢钠 （体积比为 3:1） 缓冲液 0.5mL， 混匀， 加入苯 /乙酸乙酯 （体积比 1:1） 混合溶剂 5mL， 振荡 5min，4000r/min 离心 5min，分离有机相，置于浓缩器上 60° C浓缩至干 ，残留物用甲醇 100µ L溶 解，供仪器分析。 7.1.1.2 固相萃取 移取尿液检材样品 2.0mL于具塞离心试管中，加入内标物 500ng地西泮 -D5（或多沙普仑） ，振荡 ， 转移至活化好的固相萃取柱中，控制流速为0.5 mL/min ～1.5mL/min ，依次用 1mL氨水 /甲醇 /水（体积 比2:5:93）混合溶液、 1mL 甲醇 /水（体积比 5:95）溶液淋洗，弃 去淋洗液，挤干水分或离心或真空抽 固相萃取柱 2min，用1mL二氯甲烷洗脱，收集洗脱液， 置于浓缩器上 60°C浓缩至干 ，残留物用甲醇 100µ L溶解，供 仪器分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量尿液空白样品一份于具盖离心管中 ，与检材平 行操作，得到空白样品提取液供仪器检测。 7.1.2 结合组分的水解和 提取 7.1.2.1 水解 移取尿液检材样品 2.0mL于玻璃具塞离心试管中，加入内标物 500ng地西泮 -D5（或多沙普仑）， 再加入缓冲液和β-葡萄糖醛酸苷酶，混匀，进行水解 （ β-葡萄糖醛酸苷酶使用说明参见附录 A中A.1）。 7.1.2.2 样品提取 水解后的样品按照 7.1.1步骤操作后 ，采用 7.1.2.3 衍生化。 7.1.2.3 衍生化 在7.1.2.2样品提取后的残留物中 ，加入吡啶 50µ L和醋酸酐 100µ L，振荡，置于微波炉中高火加热 3min，置于浓缩器上， 60°C空气（或氮 气）流下浓缩至干 ，残留物用甲醇 100µL溶解，供 仪器分析。 7.1.2.4 质控样品制备 取等量尿液 空白样品 1份于具盖离心管中 ，与检材平行操作。 7.2 仪器检测 7.2.1 仪器条件 （气相色谱 -质谱） 以下为参考条件， 可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱：DB-5柱（30m× 0.25mm ，0.25m）或等效色谱柱 ； 注： DB-5柱为Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对 该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 色谱柱温程： 100℃保