ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 血液、 尿液中乙基葡萄糖醛酸 苷 检验 气相色谱 -质谱和液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for ethyl glucuronide in blood and urine samples—GC-MS and LC-MS ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T × × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC179/SC1 ）提出并归口。 本标准起草单位：司法鉴定科学研究 院、公安部物证鉴定中心。 本标准主要起草人： 严慧、沈保华 、沈敏、 卓先义、刘伟、向平 、于忠山、何毅、王芳琳 。 GA/T × × × × —× × × × 1 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷检验 气相色谱 -质谱和液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷 （EtG）的气相色谱 -串联质谱（GC-MS/MS）、 液相色谱 -串联质谱 （LC-MS/MS）定性定量检验方法。 本标准适用于 法庭科学 血液、尿液中乙基葡萄糖醛酸苷的定性 分析和定量分析。其他可疑样品中 乙 基葡萄糖醛酸苷 的定性分析和定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文 件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作为对照，按平行操作的要求，对血液、尿液 进行提取（气相色谱 -串联质 谱分析前需衍生化）后 ，采用气相色谱 -串联质谱法和液相色谱 -串联质谱法定 性定量， 以保留时间、 质 谱特征离子和相对丰度比 作为定性判断依据 ；以峰面积为依据，采用内标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 气相色谱 -质谱实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的三级水 ，液相色谱 -质谱实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为 分析纯，试剂包括 ： a) 甲醇（色谱纯） ； b) 乙腈（色谱纯） ； c) BSTFA（双三甲基硅烷三氟乙酰胺 ）/TMCS（三甲基氯硅烷 ）混合溶液 （体积比 99:1）； d) 无水吡啶 ； e) 50%甲酸溶液（ 色谱纯）； f) 0.01%甲酸溶液 ：取适量水置于 1000mL容量瓶，加入 50%的甲酸溶液 0.2mL，以水定容至 刻 度； g) 标准溶液： 1） 1.0mg/mL 标准物质溶液：采用市售 EtG标准甲醇溶液，置于 冰箱中冷藏保存； GA/T × × × × —× × × × 2 2） 10.0μg/mL EtG标准工作液：吸取 0.1mL1.0mg/mL EtG标准物质溶液，用甲醇稀释 定容 至10mL，混匀，配 制成质量浓度为 10.0μg/mL的标准物质溶液，密封， 置于冰箱中 冷 藏保存。有效期 3个月； 3） 1.0mg/mL EtG-D5（内标）溶液：采用EtG-D5市售内标溶液，置于冰 箱中冷藏保存； 4） 10.0μg/mL EtG-D5（内标） 物质甲醇溶液：吸取 0.1mL标准储备液 置于 10mL容量瓶中， 用甲醇稀释定容至刻度 ，混匀，配制成 质量浓度为 10.0μg/mL的标准物质甲醇 溶液，置 于冰箱中 冷藏保存。有效期 3个月。 5.2 材料 材料包括： a) 离心管； b) 有机系微孔滤膜： 0.22µ m。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 气相色谱 -串联质谱仪 ：配有电子轰击离子源（ EI）和三重四极杆质量分析器； b） 液相色谱 -串联质谱仪 ：配有电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； c） 离心机； d） 振荡器； e） 移液器； f） 恒温水浴锅； g） 干燥箱。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 衍生化法（适用于气相色谱 -串联质谱） 移取血液或尿液 100µ L于1.5mL离心管中，加入 100ng内标物 EtG-D5和900µ L乙腈，涡旋， 10000r/min 离心 5min，转移上清液至试管， 60C水浴中空气流下吹干，残留物中加入 BSTFA /TMCS 混合溶液 66L和无水吡啶 33L，置于 90C干燥箱中反应 30min，冷却后 作为检材样品衍生液供 GC-MS/MS分析。 7.1.1.2 沉淀蛋白法（适用于液相色谱 -串联质谱） 移取血液或尿液 100µ L于1.5mL离心管中 ，加入 50ng内标物 EtG-D5和900µ L乙腈， 涡旋 ，13000r/min 离心 3min；取上清液用有机系微孔滤膜过滤 ，作为检材样品提取液 供LC-MS/MS分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品两份 于离心管中 ，一份作为空白样品，另 一份添加 EtG标准物质作为 添加样品（添加样品的质量浓度为 0.1µg/mL），与检材平行操作，得到空白样品提取液（或衍生液）和 添加样品提取液（或衍生液）供仪器分析。 GA/T × × × × —× × × × 3 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 气相色谱 -串联质谱 条件 以下条件作为参考，可根据不同仪器 和不同样品等 实际情况进行调整： a) 色谱柱： HP-1MS柱（ 30m0.25mm0.1m）或等效色谱柱 ； 注： HP-1MS柱是Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 柱温：初温 100C保持 1min，以 8C/min程序升温至 205C，再以 30C/min程序升温至 280C保 持3min； c) 进样口温度： 250C； d) 载气：氦气； e) 流速： 1mL/min； f) 进样量： 1L； 分流进样，分流比： 10:1； g) 离子源 220C； h) 接口温度： 300C； i) 碰撞气：氩气； j) 扫描方式： 多反应监测 (MRM )； k) MS参考条件见表 1。 表1 气相色谱 -串联质谱 参考条件 名 称 定量离子 对 定性离子 对 EtG 261>143 261>143 261>73 EtG-D5 266>143 266>143 266>73 7.1.2.1.2 液相色谱-串联质谱 参考条件 以下条件作为参考，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际 情况进行调整： a) 色谱柱： GL Science Inertsil ODS -3柱 (3mm× 100mm )或等效色谱柱； b) 流动相： A:0.01%甲酸水溶液 ，B:乙腈；柱后添加乙腈： 0.1mL/min ； c) 洗脱：梯度洗脱，梯度见表 2； d) 柱温：室温； e) 流速：300 L/min； f) 进样量： 2 L； 表2 梯度洗脱条件 时间 min A B 0 90% 10% 3 90% 10% GA/T × × × × —× × × × 4 12 10% 90% 13 10% 90% 15 90% 10% 20 90% 10% g) 离子源：电喷雾电离（ ESI）； h) 检测方式： 负离子； i) 离子喷雾电压： -4500V； j) 离子源温度： 450C； k) 碰撞气、气帘气等气流值应优化至最优灵敏度；扫描模式 ：多反应离子监测（ MRM）； l) MS参考条件（定性、定量离子 对和去簇电压、碰撞能量 ）见表3。 表3 液相色谱 -串联质谱 参考条件 名 称 定量离子对 定性离子对 去簇电压 V 碰撞能量 V EtG 221>75 221>75 -40 -18 221>85 -20 EtG-D5 226>75 226>75 -40 -20 226>85 -22 7.1.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品 提取液（或衍生液） 及标准工作溶液 （或衍生液） 和内标工作溶液 （或衍生液） ，按 7.1.2 .1的分析条件进样分析。 7.2 定量分析 7.2.1