ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中佐匹克隆和右佐匹 克隆检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination methods for zopiclone and eszo piclone in biological samples —LC-MS ××××-××-××发布 ×××× -××-××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T× × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1 ）提出并归口。 本标准起草单位：公安部物证鉴定中心 、北京市公安局法医检验鉴定中心 、山西山西医科大学 。 本标准主要起草人：张蕾萍、 任昕昕、王爱华、宋歌、董林沛、 于忠山、何毅、王芳琳 、乔静、杨 士云、张文芳 、贠克明、王玉瑾、尉志文。 GA/T× × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中佐匹克隆和右佐匹克隆检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材 （血、尿、肝、肾 、胃及胃内容 等）中佐匹克隆和右佐匹克隆的液 相色谱 -质谱（ LC-MS）定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材 中佐匹克隆和右佐匹克隆的定性 分析和定量分析 。其他可疑样品中 佐匹克隆和右佐匹克隆的定性 分析和定量分析可参照使用 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注 日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求 ，对生物检材进行提取、净化及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法定性定量 ，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度 比作为定性判断依据；以峰面积 为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂和材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的一级水 。除非另有说 明，在分析中使用的试剂均为分析纯， 试 剂包括： a) 二氯甲烷； b) 磷酸二氢钠 ； c) 磷酸氢二钠； d) 氨水； e) 甲醇（色谱纯）； f) 乙腈（色谱纯）； g) 二乙胺（色谱纯）； GA/T× × × × —× × × × 2 h) 异丙醇（色谱纯）； i) 乙酸铵（色谱纯）； j) 甲酸（色谱纯）； k) 乙酸乙酯 （色谱纯）； l) 环已烷（色谱纯）； m) pH值7.4磷酸盐缓冲液： 称取磷酸氢二钠 （ Na2HPO 4· 2H 2O）2.88g和磷酸二氢钠 （ NaH 2PO 4·H2O） 0.52g，加入一定量的 水溶解并 稀释至 100mL； n) 0.1%甲酸 5mmol/L 乙酸铵溶液：称取乙酸铵（ CH 3COONH 4）0.192g，加入一定量 的水溶解， 并加入 0.5mL甲酸，混匀，加水稀释至 500mL； o) 0.1%二乙胺 /乙腈溶液： 移取 1.0mL二乙胺，加入乙腈稀释至 1000mL； p) 0.1%二乙胺 /异丙醇溶液： 移取 1.0mL二乙胺，加入异丙醇稀释至 1000mL； q) 标准溶液： 1） 1.0mg/mL 标准物质溶液：根据佐匹克隆和右佐匹克隆 标准物质的纯度 和盐型换算后 ，各 称取适量， 分别用甲醇配制 1.0mg/mL 佐匹克隆和右佐匹克隆标 准物质溶液 ，置于冰箱中 冷藏保存 ，有效期 2个月。或采用市售标准溶液 ； 2） 10.0µ g/mL 佐匹克隆和右佐匹克隆 单一标准工作溶液： 分别移取 1.0mg/mL 的佐匹克隆和 右佐匹克隆 标准物质溶液各 0.1mL，用甲醇稀释至 10mL，混匀，配制成浓度为 10.0µ g/mL 的单一标准工作溶液，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 1个月。实验中所用 其他浓度 的单一标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用甲醇稀释得到； 3） 0.1mg/mL 混合标准工作溶液： 分别移取 1.0mg/mL 的佐匹克隆和右佐匹克隆 标准物质溶 液各 1.0mL，用甲醇定容至 10mL，混匀，密封，置于冰箱中冷藏保存，有效期 1个月。 实验中所用 其他浓度的混合标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质溶液用 甲醇稀释得到。 注：特殊情况下可使用对照溶液替代标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管； b) pH试纸：范围 1～14； c) 有机系微孔滤膜： 0.22µm； d) 固相萃取柱： Oasis® HLB柱或等效固相萃取柱 。 注：Oasis® HLB 柱是 Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器和设备 仪器和设备包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量 分析器； b) 凝胶渗透色谱仪 ：配紫外检测器 ； c) 电子天平 ； d) 离心机； e) 振荡器； f) 浓缩器； g) 移液器。 7 操作方法 GA/T× × × × —× × × × 3 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取绞碎的肝脏等固体 检材样品 1.0g～2.0g于具盖离心 管中，加入乙酸乙酯或二氯甲烷 5.0mL～10.0mL，振荡 10min，8000r/min 离心 10min，分离有机相，重 复提取一次，合并两次提取的有机相， 置于浓缩器上50℃下浓缩至干， 残留物用初始流动相 200µL～ 1000 µL溶解，经有机系微孔滤膜过滤 ，供仪器分析。 7.1.1.2 固相萃取 （适用于新鲜血液） 移取血液 检材样品 1.0mL～2.0 mL， 于具盖离心管中 ，加入 pH值7.4的磷酸盐缓冲液 5.0mL～10.0mL， 混匀，超声 15min，8000r/min 离心 20min，取上清液转移至已活化好的固相萃取柱中 ，控制上清液流速 为0.5mL/min ～1.0mL/min ，依次用3mL水和 3mL氨水 /甲醇（体积比 0.5:99.5）混合溶液 淋洗，用4mL二 氯甲烷洗脱， 收集洗脱液 ，置于浓缩器上50℃下浓缩至干， 残留物用初始流动相 200µL～1000µL溶解， 经有机系微孔滤膜过滤， 供仪器分析。 7.1.1.3 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品 （若无相似基质空白 样品可用血液替代） 两份于具盖离心管中 ，一份作 为空白样品 ，一份添加佐匹克隆或右佐匹克隆标准物质 ，作为添加样品（ 佐匹克隆 添加样品的浓度为 20ng/mL(g) ），右佐匹克隆 添加样品的浓度为 100ng/mL(g) ），作为添加样品，与检材样品平行操作， 得到空白样品提取液和添加样品提取液供仪器 分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 7.1.2.1.1 佐匹克隆液相色谱 -质谱条件 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整： a) 色谱柱： ZORBAX Eclipse Plus C 18色谱柱（ 2.1mm× 100mm ，1.8µm）或其他等效柱； 注： ZORBAX Eclipse Plus C 18柱为 Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不 是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 b) 流动相及梯度洗脱条件见表 1； 表1 流动相和梯度洗脱条件 c) 进样量： 1.0µL～10.0µL； d) 扫描方式：正离子扫描 （ESI+）； e) 检测方式：多反应监测 （MRM）； 时间 min 流速 mL/min 流动相 A （含 0.1%甲酸的5mmol/L 乙酸铵溶液） 流动相 B （乙腈） 0.1 0.4 90% 10% 1.0 0.4 40% 60% 2.0 0.4 40% 60% 2.1 0.4 90% 10% 4.0 0.4 90% 10% GA/T× × × × —× × × × 4 f) 电喷雾电压： 5500V； g) 离子源温度： 650℃； h) 雾化气压力： 55psi； i) 气帘气压力： 30psi； j) 辅助气压力： 50psi； k) 佐匹克隆的 MS参考条件 （定量离子对 、去簇电压、碰撞能 ）见表2。 表2 佐匹克隆的 MS参考条件 名称 保留时间 min 定量离子对