ICS 13.310 A 92 中 华人民 共和国 公共安 全行业 标准 GA GA/T × × × × －× × × × 法庭科学 生物检材中五氟利多检验 液相色谱 -质谱法 Forensic sciences —Examination method s for penfluridol in biological samples—LC-MS ×××× -×× -××发布 ×××× -×× -××实施 中华人民共和国公安部 发布 GA/T × × × × —× × × × I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 -2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析分技术委员会（ SAC/TC 179/SC 1）提出并归口。 本标准起草单位： 北京市公安司法鉴定中心（一） 。 本标准主要起草人： 杨继锋、乔静、杨士云、刘永涛、王燕燕 。GA/T × × × × —× × × × 1 法庭科学 生物检材中五氟利多检验 液相色谱 -质谱法 1 范围 本标准规定了 法庭科学 生物检材（血 液、尿液、肝脏组织）中五氟利多的液相色谱 -质谱（LC-MS） 定性定量 检验方法。 本标准适用于 法庭科学 生物检材中 五氟利多 的定性分析和定量分析。 其他可疑 样品中五氟利多 的定 性分析和定量分析可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其 最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GA/T 122 毒物分析名词术语 3 术语和定义 GA/T 122 界定的术语和定义适用于本文件。 4 原理 以空白样品 和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物检材进行提取、净化 及浓缩，采用液相 色谱 -质谱法定性定量，以保留时间、质谱特征离子碎片峰和相对丰度比 作为定性判断依据；以峰面积 为依据，采用外标法进行定量分析。 5 试剂及材料 5.1 试剂 实验用水应符合 GB/T 6682 中规定的 一级水。除非另有说明，在分析中使用的试剂均为分析纯，试 剂包括： a) 甲醇； b) 乙酸乙酯 ； c) 乙腈（色谱纯）； d) 无水硫酸钠； e) 甲酸铵（色谱纯） ； f) 甲酸（色谱纯）； g) 标准溶液 ： 1) 1.0mg/mL 标准物质溶液 ：根据五氟利多 标准物质纯度和盐型换算后， 称取适量，用甲醇 配制 1.0mg/mL 五氟利多 标准物质溶液 ，密封，置于冰箱中 2℃～ 8℃保存。 有效期 6个月。 或采用市售标准溶液 ； 2) 10.0µ g/mL 五氟利多 标准工作 溶液：移取 1.0mg/mL 的五氟利多 标准物质溶液 0.1mL，用 甲醇定容至10mL，混匀，配制成浓度为 10.0µ g/mL 的标准工作 溶液，密封，置 于冰箱中GA/T × × × × —× × × × 2 冷藏保存。有效期 3个月。实验中所用其 他浓度的标准工作溶液均由 1.0mg/mL 标准物质 溶液用甲醇稀释得到 。 注：特殊情况下可使用对照溶液代替标准溶液 。 5.2 材料 材料包括： a) 具盖离心管 ； b) 具塞玻璃试管 ； c) 一次性注射器 ； d) 有机系微孔滤膜： 0.22µ m。 6 仪器和设备 仪器和设备 包括： a) 液相色谱 -质谱仪：配电喷雾离子源（ ESI）和三重四极杆质量分析器； b) 电子天平； c) 离心机； d) 振荡器； e) 移液器； f) 浓缩器。 7 操作方法 7.1 定性分析 7.1.1 样品提取 7.1.1.1 液液萃取 移取血液等液体 检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的 肝脏等固体样品 1.0g～2.0g于具盖离心管 中，加入乙酸乙酯 4.0mL～8.0mL，振荡 5min，8000r/min 离心 10min，分离有机相；重复提取一次， 合 并两次提取的有机相，用无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器上 45℃浓缩至干， 残留物用甲醇 200L溶解， 用0.22μm的有机系微孔滤膜过滤， 作为检材样品提取液 ，供仪器分析。 7.1.1.2 质控样品制备 取等量相似基质的空白样品（若无相似基质空白样品可用血液替代）两份于具盖离心管中，一份作 为空白样品，一份添加 五氟利多 标准物质， 作为添加样品（添加样品的浓度 为5ng/mL），与检材样品 平行操作，得到空白样品提取液和添加样品提取液 ，供仪器分析。 7.1.2 仪器检测 7.1.2.1 仪器条件 （液相色谱 -质谱条件） 以下为参考条件，可根据不同品牌仪器和不同样品等实际情况进行调整 ： a) 色谱柱：Zorbax Eclipse Plus C18（2.1mm× 50mm，3.5μm）； 注： Zorbax Eclipse Plus C 18柱是Agilent公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是 表示对该产品的认可。如果其他等效 产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 GA/T × × × × —× × × × 3 b) 流速： 0.3mL/min ； c) 柱温：40℃； d) 进样量： 5μL； e) 流动相：流动相 A：20mmol/L 的甲酸胺水溶液（含 0.1％的甲酸） ，流动相 B：乙腈（含 0.1％ 的甲酸） ； f) 洗脱方式 ：梯度洗脱 ，梯度见表 1； 表1 梯度洗脱程序 时间 min A B --- 55% 45% 1.00 55% 45% 3.00 10% 90% 4.00 10% 90% 5.00 55% 45% 8.00 55% 45% g) 扫描方式：正离子扫描； h) 检测方式：多反应 离子监测（ MRM）； i) 离子源温度： 600℃； j) 雾化气： 40 psi； k) 辅助加热气： 40 psi； l) 气帘气： 20 psi； m) 碰撞气： medium； n) MS参考条件（ 定性、定量离子和去簇电压、碰撞能量 ）见表 2。 表2 MS参考条件 目标物 定性离子 对 定量离子 对 去簇电压 V 碰撞能量 eV 五氟利多 524.1>109.3 524.1>109.3 164 75 524.1>149.2 53 524.1>203.7 58 524.1>274.2 60 524.1>292.1 50 7.1.2.2 进样 分别吸取空白、检材和添加样品提取液 及标准工作溶液， 按7.1.2.1分析条件 进样分析 。 7.2 定量分析 7.2.1 样品提取 移取血液等液体检材样品 1.0mL～2.0mL，或称取铰碎的肝脏等固体检材样品 1.0g～2.0g两份，按 7.1.1.1进行操作。 GA/T × × × × —× × × × 4 另取等量相似基质的空白样品 四份，其中一份作为空白样品 ，另三份根据五氟利多在不同基质中的 线性范围，分别添加低、中、高 浓度的五氟利多 （定容后浓度为测定下限、线性范围中点、测定上限） ， 混匀后静置 24h以上，然后按 7.1.1.1平行操作。 7.2.2 仪器检测 7.2.2.1 仪器条件 按7.1.2.1规定的条件分析。 7.2.2.2 进样 分别吸取检材、空白和添加样品提取液及标准工作溶液，按 7.1.2.1的分析条件每个样品进样分析 2～3次。若要报告测量不确定度，每个样品分析次数应不少于 6次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计算含量 记录各样品中五氟利多定量离子的峰面积值，同一样品 两次峰面积值相对相差 小于等于 5%。以添 加低、中、高的样品浓度（ ng/mL或ng/g，即样品中添加五氟利多质量 /样品体积或质量 ）为横坐标， 对应浓度的 两次峰面积均值为纵坐标建立回归方程 Y=Wb+a，当r≥0.998时可以用回归方程来定量检材 含量（参见附录 A）。如果不在线性范围内，则 应对定容液进行稀释或对检材取样量进 行调整。 按公式（1）计算含量： ................................ ................................ ................. (1) 式中： W—检材样品中五氟利多的含量，单位为纳克每克或纳克每毫升 (ng/g或ng/mL)； Y—检材样品提取液中五氟利多 峰面积平均值； a—线性方程的截距； b—线性方程的斜率。 7.2.3.2 计算相对相差 记录两份平行操作的 检材样品中目标物的 含量，按公式（ 2）计算相对相差： %1002 1−= XXXRD ................................ ................................ ..... (2) 式中： RD－相对相差 ，用百分比（ %）表示； X1、X2－两个检材 样品平行定量测定的含量数值； X －两